改进的HVT作为载体的ND‑IBD疫苗制造技术

本发明专利技术涉及针对目标动物的新的和改进的HVT作为载体的ND‑IBD疫苗，其含有包含来自IBDV的VP2基因和来自NDV的F基因的重组HVT。重组HVT可用于家禽疫苗中，所述家禽疫苗相对于现有技术构建体展现NDV F‑和IBDV VP2基因的良好的病毒载体复制、有效表达，针对ND和IBD的改进的免疫保护以及改善的遗传稳定性。

The improved HVT as a carrier of ND IBD vaccine

The present invention relates to new and improved animal HVT as carrier ND IBD vaccine containing VP2 contains genes from IBDV and NDV from the F gene recombinant HVT. Recombinant HVT can be used for poultry vaccine, the poultry vaccine with respect to construct show good virus vector and IBDV F NDV VP2 gene replication and effective expression of the existing technology, the genetic stability of protective immunity against ND and improved IBD and improved.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】改进的HVT作为载体的ND-IBD疫苗本专利技术涉及兽医疫苗、即基于重组火鸡疱疹病毒(HVT)作为病毒载体的针对ND和IBD的家禽疫苗的领域。具体而言，本专利技术涉及重组DNA表达盒，包含重组DNA表达盒的重组HVT，基于重组HVT或包含重组HVT的宿主细胞的家禽疫苗。此外，本专利技术涉及表达盒、重组HVT和宿主细胞用于疫苗的制备和使用的方法和用途。马立克氏病(MD)是世界范围内发生的高度传染性的家禽疾病，并且其特征在于在几种器官和神经中存在T细胞淋巴瘤。这导致各种症状，尤其是麻痹和死亡。新生雏鸡可以被来自免疫母体的母体来源的抗体(MDA)保护。MD由马立克氏病病毒(MDV)引起，所述马立克氏病病毒(MDV)属于α疱疹病毒亚科和马立克病毒属。病毒粒子是有包膜的，并且大小约160nm。在衣壳内包含大小为100和200kbp之间的线性双链DNA的大基因组。存在不同血清型的MDV，其各自具有不同的特征。尽管MDV血清型1(MDV1)和MDV2对家禽致病，但MDV3没有。MDV3更通常被称为：Meleagrid疱疹病毒1，火鸡疱疹病毒，但通常为：火鸡疱疹病毒(HVT)。HVT在1970年被描述为对鸡不致病(apathogenic)的火鸡疱疹病毒(Witter等人,1970,Am.J.Vet.Res.,vol.31,p.525)。自那时起HVT毒株例如PB1或FC-126已通常用于针对由MDV1或MDV2引起的MD接种鸡。并且在需要针对毒力更强的MDV1变体的保护的情况下，HVT与MDV2疫苗毒株例如SB1组合使用，如在Nobilis™MarexineCA126+SB1(MSDAnimalHealth)中，或与减毒MDV1疫苗毒株例如Rispens组合，例如在Nobilis™RISMAVAC+CA126(MSDAnimalHealth)中。HVT在鸟类的外周血淋巴细胞(PBL)中复制，并且因此是诱导主要针对细胞免疫系统的长持续时间的免疫反应的全身性病毒。HVT疫苗作为冷冻的HVT感染的细胞市售，并且可以在早期应用于鸡，因为它们对于针对HVT的抗体相对不敏感(例如MDA中)。因为新出生的雏鸡从其第一天起面临MDV的感染压力，因此HVT疫苗尽可能早地(例如在其从蛋中孵化的当天(第一天)，或甚至在孵化前仍在蛋中时)接种到雏鸡内。该后一种方法，所谓的‘卵内接种(inovovaccination)’，是胚胎接种的形式，其通常在胚胎发育(ED)的第18天(在孵化前约3天)应用。除了用作疫苗本身之外，HVT还被用作用于将各种免疫原性蛋白表达和递送给家禽的病毒载体疫苗，参见例如，WO87/04463。通常，表达的基因编码对需要针对其接种的家禽致病的微生物的保护性抗原(的一部分)。多年来，许多异源基因已经在HVT载体中表达，例如来自：新城疫病毒(NDV)(Sondermeijer等人,1993,Vaccine,vol.11,p.349-358)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)(Darteil等人,1995,Virology,vol.211,p.481-490)和寄生虫抗原(Cronenberg等人,1999,ActaVirol.,vol.43,p.192-197)。HVT载体疫苗向家禽的施用因此生成针对所表达的异源基因、以及针对HVT(其针对MD进行保护)的免疫反应。这应用于多种商业HVT载体疫苗产品中，例如：NDVF蛋白基因：Innovax™-ND(MSDAnimalHealth)，和Vectormune™HVT-NDV(Ceva)；或IBDVVP2基因：Vaxxitek™HVT+IBD(Merial；先前命名为：Gallivac™HVT-IBD)、和Vectormune™HVT-IBD(Ceva)。或者，HVT载体可用于表达和递送治疗性蛋白，例如细胞因子，以操纵鸡的免疫反应(WO2009/156.367;Tarpey等人,2007,Vaccine,vol.25,p.8529-8535)。HVT的基因组核苷酸序列例如可作为：AF291866(毒株FC-126)得自GenBank™。已描述了用于将异源基因插入HVT内的几种方法，例如通过使用同源重组(Sondermeijer等人，同上)、粘粒再生(US5,961,982)或杆粒(细菌人工染色体)(Baigent等人，2006，J.ofGen.Virol.，vol.87，p.769-776)。用于将异源基因构建体插入HVT基因组内的许多遗传位置已进行研究，并且几个合适的非必需基因座已得到描述，例如在HVT基因组的独特短(Us)区(uniqueshortregion)中(EP431.668)；或在HVT独特长(UL)区(uniquelongregion)中(EP794.257)。不同启动子已用于驱动异源基因在HVT的表达盒中的表达，例如：PRVgpX启动子(WO87/04.463)，劳斯肉瘤病毒LTR启动子、SV40早期基因启动子，鸡β-肌动蛋白基因启动子(EP1.298.139)或来自人(hCMVIE1)或鼠(mCMVIE1)巨细胞病毒的立即早期1基因启动子，参见：EP728.842。近来，描述了HVT载体疫苗，其表达来自单一构建体的NDV和IBDV的抗原：WO2013/057.235。对于重组载体的构建，待插入载体的基因组内的异源核酸通常包含至少一个异源基因或编码区，其编码抗原(的至少免疫原性部分)。而且，构建体可以包含启动子序列以驱动异源基因的表达和调节信号例如增强子或转录终止子。此组合的插入片段通常称为‘表达盒’。表达盒插入载体的基因组内的作用不同，这取决于其插入的位置和方式：载体基因组的大小可以变得更大、相同或更小，这取决于对基因组的净结果是否分别是遗传材料的添加、替换或缺失。插入位置也可以具有作用：置于基因组的编码区、非编码区或调节区内。其中，这些选择影响了所得载体疫苗在其复制和表达能力及其遗传稳定性方面的特征。无论构建体多么精确，插入的表达盒必须允许活的重组病毒载体克服对其稳定性和功效的许多生物应激：首先，在已接受异源插入片段后复制和生成后代的能力。这指示尽管插入其基因组内，但重组载体病毒本身仍是活的。接下来，在体外在宿主细胞系中复制多个循环，同时正确地和完全地保持异源插入片段的复制和表达的能力。这指示重组体未由于插入而在其复制方面减弱，并且插入的表达盒是稳定维持且表达的。第三，体内复制和表达。这指示重组病毒可以克服活动物中例如由其免疫系统造成的强选择压力。在这个环境中，载体对异源基因的表达丧失会有利于在动物中的更快速复制；此类‘逃避突变体(escapemutants)’可以具有在外源基因或在其调节序列中的获得性突变或主要缺失，并且该突变体可以使完整病毒载体过度生长。最后且最重要的是，在目标中的载体的复制和异源基因的表达需要能够生成有效的针对微生物的免疫反应，所述微生物是载体表达的异源插入片段的供体。因而，重组载体疫苗必须提供载体及其插入片段在体外和体内的良好复制，和一种或多种异源基因在体内的有效表达，其优选为高水平并随着时间保持一致，以诱导且维持目标中的保护性免疫反应。这个特征组合将允许在体外的大量轮次的复制(这是大规模生产必需的)以及当载体疫苗在接种的目标动物中本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组DNA表达盒，其以5'至3'方向且以该顺序包含：a. 鼠巨细胞病毒立即早期1基因(mCMV‑IE1)启动子，b. 传染性法氏囊病病毒(IBDV)病毒蛋白2(VP2)基因，c. 转录终止子，d. 人巨细胞病毒立即早期1基因(hCMV‑IE1)启动子，e. 新城疫病毒(NDV)融合(F)蛋白基因。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.12.24 EP 14200340.91.重组DNA表达盒，其以5'至3'方向且以该顺序包含：a.鼠巨细胞病毒立即早期1基因(mCMV-IE1)启动子，b.传染性法氏囊病病毒(IBDV)病毒蛋白2(VP2)基因，c.转录终止子，d.人巨细胞病毒立即早期1基因(hCMV-IE1)启动子，e.新城疫病毒(NDV)融合(F)蛋白基因。2.根据权利要求1所述的重组DNA表达盒，其中选自以下的条件中的一种或多种或全部适用：mCMV-IE1基因启动子是完整的启动子；IBDVVP2基因编码来自经典型IBDV的VP2蛋白；转录终止子包含终止区和polyA区两者；转录终止子源自猿猴病毒40(SV40)；hCMV-IE1基因启动子是核心启动子；NDVF基因来自弱毒NDV毒株；表达盒包含位于NDVF基因下游的额外转录终止子；且额外转录终止子源自hCMV-IE1基因。3.重组DNA分子，其包含根据权利要求1或2中任一项所述的重组DNA表达盒。4.重组火鸡疱疹病毒(HVT)，其包含根据权利要求1或2中任一项所述的重组DNA表达盒，由此将所述表达盒插入重组HVT的基因组的Us区。5.宿主细胞，其包含根据权利要求4所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：I维斯特根，PJA森德梅杰，P维梅吉，
申请(专利权)人：英特维特国际股份有限公司，
类型：发明
国别省市：荷兰,NL