通过电穿孔高效率、高通量产生遗传修饰哺乳动物制造技术

本文所述的发明专利技术提供通过电穿孔将材料引入配子或植入前期(例如单细胞胚胎或合子)中产生转基因动物(例如哺乳动物)的高通量方法和试剂，使动物的基因组产生可基因遗传的修饰。

Genetic modification of mammals with high efficiency and high throughput by electroporation

The invention provides the material is introduced into gametes or pre implantation by electroporation (e.g. single cell or zygote embryo) produced in transgenic animal (such as mammals) high-throughput methods and reagents, the animal genome can produce genetic modification.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过电穿孔高效率、高通量产生遗传修饰哺乳动物相关申请的交叉引用本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2014年9月29日提交的美国临时申请号62/056,687的申请日的权益，该临时申请全部内容通过引用并入本文。
技术介绍
将生物或遗传材料递送到哺乳动物合子中通常是修饰哺乳动物基因组的第一步，例如遗传修饰动物模型的创建。这在传统上和目前通过使用玻璃针将期望生物/遗传材料显微注射到合子中而实现。DNA直接显微注射早在80年代末就已经用于将单纯疱疹病毒(HSV)TK基因引入培养的哺乳动物细胞(Capecchi，Cell，22:479-488，1980年11月)。然而，即使在小的pBR322/TKDNA与SV40DNA共注射，即每1,000个细胞注射15个转化体时，转化率也是极低的。此外，该实验不导致产生成熟生物体，更不用说可以表现出表型改变。大约一个月后，Gordon等(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,77:7380-7384,1980年12月)首先报道了他们已经成功将TK基因(其被引入到嵌合SV40病毒载体中)显微注射到小鼠胚胎中，并已经在从显微注射的胚胎发育的小鼠中观察到这样的TK基因。然而，这些小鼠不表达TK基因产物。也就是说，在这些实验中，没有实现测试动物的表型改变。Gordon等报道的结果似乎与Jaenisch等人早期的研究(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,71:1250-1254,1974)一致，其中SV40病毒先前已经被证明在引入小鼠胚胎时在功能和遗传上无活性。随后，在1981年6月，Wagner和Hoppe提交了针对通过显微注射将外源遗传材料引入胚胎的美国技术申请，该申请最终导致美国专利No.4,873,191的授权，其是在显微注射领域中广泛许可的基础专利，描述并广泛要求保护获得具有含有并能够表达外源遗传材料的细胞的哺乳动物的显微注射方法。尽管自80年代初以来已有许多改进，显微注射仍然技术上苛刻、劳动密集并且耗时。成功的显微注射在很大程度上取决于操作员的技术熟练程度、培训和经验等主观因素。由于它需要在昂贵的显微注射设备和具有多年培训和经验的操作者方面进行大量的前期投资，即使在世界上最优秀和资金最充分的学术机构中，生产遗传修饰小鼠模型的能力也经常受到限制。此外，显微注射在通量方面固有地低，需要一次操纵一个合子，从而限制基因组工程实验的大小和规模。电穿孔或电渗透是通过使用外部施加的电场显著地增加细胞质膜渗透性和导电性的方法。电穿孔已经在分子生物学中用作将某些材料引入细胞的方式，例如用分子探针、可改变细胞功能的药物或DNA分子加载它。在分子生物学中，电穿孔方法通常用于细菌、酵母和植物原生质体的转化。除了脂质膜外，细菌还具有与脂质膜不同并且由肽聚糖及其衍生物构成的细胞壁。然而，细胞壁是天然多孔的并且只用作保护细菌免受严重环境影响的硬壳。如果细菌和质粒混合在一起，则质粒可以在电穿孔后转移到细胞中。在这个方法中通常在几毫米距离上使用数百伏。该程序也可以用于组织培养细胞，例如培养的哺乳动物细胞。与细菌中的转化相反，将外源DNA引入真核细胞的过程通常称为转染。电穿孔已经用于使用电穿孔电击杯转染悬浮体中的细胞。尽管有着克服上述显微注射的许多障碍，包括低效率/低通量和技术困难的巨大和明显需要，电穿孔尚未被本领域技术人员看做可行的替代方法，并且尚未有报道使用电穿孔将遗传材料引入哺乳动物胚胎，其随后发育成遗传修饰动物。具体来说，电穿孔以前主要用于小鼠中的组织培养细胞和植入后胚胎(参见Mellitzer等.,Mech.Dev.,118:57-63(2002)；Akamatsu等.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,96:9885-9890(1999)；Potter等.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81:7161-7165(1984)；Osumi和Inoue,Methods,24:35-42(2001)；Fukuchi-Shimogori和Grove,Science294:1071-1074(2001)以及Tabata和Nakajima,Neuroscience,103:865-872(2001))。在一项研究中，Nemec等(Theriogenology31:233,1989)描述了通过电穿孔将新霉素抗性基因(pSVNEO)引入小鼠1-细胞胚胎(即，合子)中的尝试。然而，首先将包含新霉素基因的DNA注射到合子的质膜与透明带之间的卵周隙中，以据作者所说在合子经受电击之前，在暴露于电流时减少外源DNA与原核之间的距离。作者报道在一个实验中，DNA印迹分析显示从转移到假孕ICR受体的226个胚胎产生的55只幼仔中没有引入新霉素基因。在使用旨在在电穿孔脉冲期间增加传递的总能量的高盐介质的后续实验中，作者再次报道初步数据表明种系传递未成功。最近，电穿孔已经成功用于将dsRNA、siRNA、编码它们的DNA载体和吗啉基化合物递送到小鼠植入前胚胎中(Grabarek等.,Genesis,32:269-276(2002)；Wang等.,Dev.Biol.,318:112-125(2008)；和Peng等.,PLoSONE,7(8):e43748.doi:10.1371/journal.pone.0043748(2012))。然而，这些试剂在细胞质中起作用，而不是在细胞核中，如实现可以通过种系传递的遗传修饰所需要的。更具体地说，这些试剂通过降解靶基因的mRNA或通过阻断mRNA的翻译或两者而抑制其各自的靶基因的表达而起作用。因此，尽管有着克服用于通过种系传递将外源生物或遗传材料引入早期胚胎以产生遗传修饰动物的显微注射的许多缺点(例如低效率)的长期需要，该流行技术似乎教导远离看似简单的技术，如电穿孔。
技术实现思路
本专利技术的一个方面提供了产生遗传修饰哺乳动物的方法，所述方法包括通过电穿孔将材料引入到哺乳动物的配子或植入前期胚胎中以修饰所述哺乳动物的基因组。在某些实施方式中，将材料引入到配子中。例如，配子可以是卵子(ovum)或卵(egg)。在某些实施方式中，所述方法还包括将配子与相反性别的配子融合，并允许发育成活胎产的遗传修饰哺乳动物。在某些实施方式中，植入前胚胎是1-细胞胚胎(即，合子)、2-细胞胚胎、4-细胞胚胎、早期桑椹胚或晚期桑椹胚。在某些实施方式中，所述方法还包括允许(电穿孔的)植入前期胚胎发育成活胎产的遗传修饰哺乳动物。在某些实施方式中，材料包含多核苷酸、多肽(例如蛋白)或多核苷酸和多肽两者。在某些实施方式中，多聚核苷酸包含II型Cas9蛋白的编码序列。在某些实施方式中，多核苷酸包含规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)-CRISPR相关(Cas)(CRISPR-Cas)系统指导RNA，其与哺乳动物的基因组中的靶序列杂交。在某些实施方式中，II型Cas9蛋白和CRISPR-Cas系统指导RNA的编码序列的浓度比是至少约1:1、至少约1.5:1、至少约2:1、至少约2.5:1、至少约3:1或更高。在某些实施方式中，II型Cas9蛋白的编码序列的浓度是至少约40ng/μL、至少50ng/μL、至少100ng/μL、至少150ng/本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产生遗传修饰哺乳动物的方法，所述方法包括通过电穿孔将材料引入到哺乳动物的配子或植入前期胚胎中以修饰所述哺乳动物的基因组。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.09.29 US 62/056,6871.一种产生遗传修饰哺乳动物的方法，所述方法包括通过电穿孔将材料引入到哺乳动物的配子或植入前期胚胎中以修饰所述哺乳动物的基因组。2.权利要求1所述的方法，其中将所述材料引入到所述配子中。3.权利要求2所述的方法，其中所述配子是卵子或卵。4.权利要求2或3所述的方法，其还包括将所述配子与相反性别的配子融合，并允许发育成活胎产的遗传修饰哺乳动物。5.权利要求1所述的方法，其中所述植入前期胚胎是1-细胞胚胎(即，合子)、2-细胞胚胎、4-细胞胚胎、早期桑椹胚或晚期桑椹胚。6.权利要求5所述的方法，其还包括允许使所述(电穿孔的)植入前期胚胎发育成活胎产的遗传修饰哺乳动物。7.权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述材料包含多核苷酸、多肽或两者。8.权利要求7所述的方法，其中所述多核苷酸包含II型Cas9蛋白的编码序列。9.权利要求7或8所述的方法，其中所述多核苷酸包含规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)-CRISPR相关(Cas)(CRISPR-Cas)系统指导RNA，其与所述哺乳动物的基因组中的靶序列杂交。10.权利要求9所述的方法，其中所述II型Cas9蛋白与所述CRISPR-Cas系统指导RNA的编码序列的浓度比是至少约1:1、至少约1.5:1、至少约2:1、至少约2.5:1、至少约3:1或更高。11.权利要求8-10中任一项所述的方法，其中所述II型Cas9蛋白的编码序列的浓度是至少约40ng/μL、至少50ng/μL、至少100ng/μL、至少150ng/μL、至少200ng/μL、至少300ng/μL、至少400ng/μL、至少500ng/μL、至少600ng/μL、至少800ng/μL、或至少1000ng/μL或更高。12.权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述材料还包含供体多核苷酸。13.权利要求12所述的方法，其中所述供体多核苷酸是线性或环状双链DNA分子。14.权利要求7所述的方法，其中所述多核苷酸包含对所述哺乳动物的基因组中的靶序列具有特异性的转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)的编码序列。15.权利要求7所述的方法，其中所述多核苷酸包含对所述哺乳动物的基因组中的靶序列具有特异性的锌指核酸酶(ZFN)的编码序列。16.权利要求7所述的方法，其中所述多核苷酸包含对所述哺乳动物的基因组中的靶序列具有特异性的BuD衍生核酸酶(BuDN)的编码序列。17.权利要求7所述的方法，其中所述多核苷酸包含随机整合到所述哺乳...

【专利技术属性】
技术研发人员：覃文宁，S·L·迪昂，P·M·库特奈，王皓毅，
申请(专利权)人：杰克逊实验室，
类型：发明
国别省市：美国,US