本发明专利技术公开了一种合成树枝状多聚赖氨酸衍生物的制备方法，采用修饰芴甲氧羰基氨基酸的４－羟基甲基苯氧甲基聚苯乙烯树脂为固相合成介质，与Ｎ↑［α］，Ｎ↑［ε］－双芴甲氧羰基赖氨酸发生步进式重复缩合反应，生成的含有芴甲氧羰基保护基团的三代树枝状聚赖氨酸，其与含羧基的化合物进一步反应制得含保护基团的多聚赖氨酸衍生物树脂依次经哌啶／二氯甲烷脱保护和三氟乙酸裂解方法将多聚赖氨酸衍生物从树脂上切下，再经无水乙醚沉淀出单侧支化的多聚赖氨酸衍生物。以上述方法制备的、通过表层分枝单元的化学修饰制备的聚合物载体分子的单一性更高，且具有较好的生物相容性，其在基因治疗过程中可作为运载核酸物质的载体，也可作为抗原、诊断造影剂的载体加以应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种由氨基酸出发构建的用于基因治疗且生物可降解的树枝状聚合物方法，属于非病毒基因治疗载体的制备技术。
技术介绍
自上世纪九十年代发展起来的基因治疗技术从根本上改变了传统的药物治疗的观念，并为根治众多的单基因疾病、肿瘤和遗传病带来了希望。高效、安全的基因治疗载体是基因治疗方案中首要的环节。在过去相当长的一段时间内，以逆转录病毒、腺病毒为代表的病毒类载体一直在基因治疗中起着举足轻重的作用。1999年，美国发生了基因治疗过程中志愿者死亡的重大事件，当时使用的载体即为腺病毒载体；此后法国也发生了类似的情况。这一系列的事件的发生使人们对于病毒类载体的安全性产生了置疑，同时病毒类载体所表现出的容量小、制备难、费用高等缺陷也限制了其发展。在这种情况下，非病毒基因治疗载体的研究开始受到愈来愈多地重视。非病毒类载体是一种药物的控制释放技术，利用合成或天然的化合物将视为药物的治疗基因导入靶细胞或组织并进行表达。常用的载体包括脂质体、聚合物、裸DNA等。作为研究中常用的一类非病毒基因运载手段，聚合物载体多以线性阳离子聚合物为主并通过其表面氨基所带的正电荷与DNA负电荷间的静电引力使DNA分子缩合成高稳定性、小粒径的复合物(polyplex)。这种由静电作用而引发的缩合一直被视为质粒跨膜运输的主要手段。线性聚合物载体虽多见于实验室研究中，其在临床上的应用仍鲜有报道。造成这种情况的主要原因之一在于其存在着一定的分子量分布，从而造成了代谢途径和毒性的差异及药理上的不确定性，从而限制了其在临床上的应用。而树枝状聚合物以其规则的支化单元、独有的合成方式避免了上述的问题，从而展现出巨大的医学应用潜力。Denkewalter等人率先从Nα，Nε-双叔丁氧羰基赖氨酸出发采用液相合成技术获得了树枝状聚赖氨酸(US4,410,688，)。不久，Dow化学公司也公开了树枝状聚氨基酰胺合成的专利(PCT/US83/02052)。Haensel等人首次尝试将其应用于细胞转染过程(Bioconjugate Chem，4372，1993)。此后，Szoka等人则公布了树枝状聚氨基酰胺末端修饰聚乙二醇、多糖、短肽促进核酸运输的方法(WO 95/02397)。近来，美国专利US2003/0096280公开了抗生物素蛋白与树枝状聚氨基酰胺偶联的方法。而有马英俊和本原史博则公布了环糊精与树枝状聚氨基酰胺偶联的制备工艺。Baidude亦报道了采用液相合成技术在树枝状聚赖氨酸表面偶联多糖的方法(Macromolecules，367100，2003)。通过上述的技术手段可以有效地提高聚合物/核酸复合物与靶细胞及其亚细胞器的亲和性，从而实现高通量的核酸转运。从根本上讲，高效率的核酸转运往往是在较小的核酸颗粒粒径下实现的。而病毒基因组的高效组装表明，上述过程是一个多种作用力驱动的结果(Annu Rev Biochem，671，1998)，而非单一的静电作用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种合成由高度支化的多肽链构成的树枝状多聚赖氨酸衍生物的方法，以上述方法制备的、通过表层分枝单元的化学修饰制备的聚合物载体分子的单一性更高，且具有较好的生物相容性，其可作为在基因治疗过程中运载核酸物质的载体，也可作为抗原、诊断造影剂的载体加以应用。本专利技术是通过下述技术方案加以实现的，一种，其特征在于包括以下过程，(1)用体积比为25～80％哌啶/二氯甲烷溶液与修饰密度为0.02～4.0mmol/g的芴甲氧羰基氨基酸的4-羟基甲基苯氧甲基聚苯乙烯树脂在4～40℃下反应5～120分钟脱去芴甲氧羰基(Fmoc)保护基团，然后用二氯甲烷和乙醇洗涤至中性；(2)将脱保护的修饰氨基酸的4-羟基甲基苯氧甲基聚苯乙烯树脂加入到按每克树脂加入下述物质量0.1～12mmol Nα，Nε-双芴甲氧羰基赖氨酸、0.4～20ml二甲基甲酰胺(DMF)和10～530mg N-羟基苯并三唑(HOBt)混合溶液中，然后再加入0.1～5ml 1，3-二异丙基碳二亚胺(DIC)，在4-40℃反应2-96小时后用二氯甲烷、乙醇洗涤得到含一代聚赖氨酸的树脂；然后将含一代聚赖氨酸的树脂加入到重新配制的上述反应液中合成含有二代聚赖氨酸的树脂，其中Nα，Nε-双芴甲氧羰基赖氨酸用量为每克树脂0.2～25mmol；反应得到的含有二代聚赖氨酸的树脂经二氯甲烷、乙醇洗涤后加入到新配制的反应液中合成含有三代聚赖氨酸的树脂，其中Nα，Nε-双芴甲氧羰基赖氨酸用量为每克树脂0.3～50mmol；(3)用体积比为25～80％哌啶/二氯甲烷溶液与芴甲氧羰基团保护的三代聚赖氨酸树脂在4～40℃下反应5～120分钟脱去芴甲氧羰基保护基团，然后用二氯甲烷和乙醇洗涤至中性；将脱保护的树脂加入到按每克树脂加入下述物质量0.4～40mmol含羧基的化合物、1～20mlDMF和50～530mg HOBt混合溶液中，然后再加入0.3～6ml DIC，在4～40℃下反应2-120小时； (4)体积比为0.5-5的三氟乙酸/二氯甲烷溶液与脱保护后的树脂在4～40℃下反应10-180min；(5)最后用二氯甲烷溶液冲洗树脂若干次，归并滤液，旋转蒸发至体积不再变化后加入大量无水乙醚并离心收集，所得到沉淀即为产物。上述的合成过程中树脂上芴甲氧羰基氨基酸修饰密度为0.1～2.0mmol/g，Nα，Nε-双芴甲氧羰基赖氨酸加入量为每克树脂0.4～10mmol，DMF的体积为每克树脂1.0～12ml，HOBt的用量为每克树脂50～300mg，DIC的加入量为每克树脂0.2～6ml；合成二、三代聚赖氨酸树脂过程中Nα，Nε-双芴甲氧羰基赖氨酸用量为每克树脂0.6～20mmol；脱保护试剂中哌啶和二氯甲烷体积比为30～70％，脱保护过程在15～30℃下进行20～80min；表面分枝单元层修饰中含羧基化合物加入量为每克树脂1～30mmol，DMF的体积为每克树脂2～14ml，HOBt的用量为每克树脂80～400mg，DIC的加入量为每克树脂0.5～5ml；产物切割过程中，三氟乙酸与二氯甲烷体积比为0.8～3，反应在15～30℃下持续30-120min。通过上述方法得到聚合物载体生物降解性好、毒性小，具有非常广阔的实际应用前景。下面对本专利技术进行详细说明。本专利技术的关键技术有六点一是固相合成方法的选择。树枝状聚赖氨酸的合成均采用液相合成及其派生的合成方法，如以聚乙二醇为载体的液相合成方法。这些方法的显著特点是合成过程中由于无需载体(如液相合成)或者载体的空间位阻小(如线性聚乙二醇的使用)，因此合成速度较快；另一方面，这也造成了后续分离过程复杂以及产物的收率低。而本专利技术所采用的固相合成方法虽然在合成速度上略逊于液相合成，但其后续的处理步骤非常简单、迅速，从而部分弥补了合成速度的不足。二是合成原料树脂的确定。合成用树脂可以自主合成，也可采用市场化产品，如上海吉尔生化公司的100～200目、芴甲氧羰基氨基酸修饰密度为0.5mmol/g的Wang树脂或Sigma公司的芴甲氧羰基氨基酸修饰密度为0.8mmol/g的Wang树脂，所涉及的氨基酸可以是任意一种氨基酸。三是Nα，Nε-双芴甲氧羰基赖氨酸的制备。高纯度的Nα，Nε-双芴甲氧羰基赖氨酸是获得分子量单一产物的关键因本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于基因治疗的树枝状聚赖氨酸衍生物载体的制备方法，其特征在于包括以下过程，（１）用体积比为２５～８０％哌啶／二氯甲烷溶液与修饰密度为０．０２～４．０ｍｍｏｌ／ｇ的芴甲氧羰基氨基酸的４－羟基甲基苯氧甲基聚苯乙烯树脂在４～４０℃下反 应５～１２０分钟脱去芴甲氧羰基保护基团，然后用二氯甲烷和乙醇洗涤至中性；（２）将脱保护的修饰氨基酸的４－羟基甲基苯氧甲基聚苯乙烯树脂加入到按每克树脂加入下述物质量：０．１～１２ｍｍｏｌＮ↑［α］，Ｎ↑［ε］－双芴甲氧羰基赖氨酸、 ０．４～２０ｍｌ二甲基甲酰胺和１０～５３０ｍｇＮ－羟基苯并三唑混合溶液中，然后再加入０．１～５ｍｌ１，３－二异丙基碳二亚胺，在４－４０℃反应２－９６小时后用二氯甲烷、乙醇洗涤得到含一代聚赖氨酸的树脂；然后将含一代聚赖氨酸的树脂加入到 重新配制的上述反应液中合成含有二代聚赖氨酸的树脂，其中Ｎ↑［α］，Ｎ↑［ε］－双芴甲氧羰基赖氨酸用量为每克树脂０．２～２５ｍｍｏｌ；反应得到的含有二代聚赖氨酸的树脂经二氯甲烷、乙醇洗涤后加入到新配制的反应液中合成含有三代聚赖氨酸的树脂，其中Ｎ↑［α］，Ｎ↑［ε］－双芴甲氧羰基赖氨酸用量为每克树脂０．３～５０ｍｍｏｌ；（３）用体积比为２５～８０％哌啶／二氯甲烷溶液与芴甲氧羰基团保护的三代聚赖氨酸树脂在４～４０℃下反应５～１２０分钟脱去芴甲氧羰基保护基团，然后用二氯甲烷和 乙醇洗涤至中性；将脱保护的树脂加入到按每克树脂加入下述物质量：０．４～４０ｍｍｏｌ含羧基的化合物、１～２０ｍｌ二甲基甲酰胺和５０～５３０ｍｇＮ－羟基苯并三唑混合溶液中，然后再加入０．３～６ｍｌ１，３－二异丙基碳二亚胺，在４～４０℃下 反应２－１２０小时；（４）体积比为０．５－５的三氟乙酸／二氯甲烷溶液与脱保护后的树脂在４～４０℃下反应１０－１８０ｍｉｎ；（５）最后用二氯甲烷溶液冲洗树脂若干次，归并滤液，旋转蒸发至体积不再变化后加入大量无水乙醚并离心收集， 所得到沉淀即为产物。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：史清洪，郝挥红，董晓燕，白姝，孙彦，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]
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