可用于基因治疗和治疗性筛选的eNOS突变制造技术

本发明专利技术涉及在依赖Ａｋｔ的磷酸化位点具有结构变化的新的ＮＯＳ变异体和突变体。改变后的ＮＯＳ蛋白质或肽（尤其是人ｅＮＯＳ蛋白质或肽）、Ａｋｔ蛋白质或肽、及其编码核酸分子，可以作为基因治疗剂治疗血管成形术后再狭窄、高血压、动脉粥样硬化、心力衰竭、糖尿病、和血管发生缺陷等疾病。ＮＯＳ蛋白质和肽还可用于筛选调节ＮＯＳ活性的试剂的方法。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及在依赖Akt的磷酸化位点处结构改变的新的NOS变体和突变体。改变后的NOS蛋白质或肽及其编码核酸分子，可以作为基因治疗剂用于治疗疾病血管成形术后再狭窄、高血压、动脉粥样硬化、心力衰竭、糖尿病、和血管发生缺陷的疾病。
技术介绍
动脉粥样硬化和血管血栓症是导致冠状动脉疾病、心肌梗死、和中风的发病和死亡的主要原因。动脉粥样硬化是从血管的内皮的变化开始。内皮的变化可能最终导致部分由摄取氧化态低密度脂蛋白(LDL)胆固醇引起的内皮病灶的发展。这种病灶的破损可以导致血栓形成和血管阻塞。在冠状动脉的情况中，复合病灶的破损可能促成心肌梗死；而在颈动脉的情况中，可能随之发生中风。在动脉粥样硬化性冠心病中，内皮功能障碍可以减少血管扩张物质(诸如一氧化氮)的产生。当由于限流性冠状动脉狭窄或内皮功能障碍导致自动调控的血管舒张受到阻碍时，则发生心肌缺血。在这两种情况中，动脉血流不再能够随上升的氧需求而成比例增加。在其它情形中，当氧需求保持不变，但存在冠状动脉痉挛导致冠状动脉血流明显减少，下面的动脉粥样硬化性斑块快速发展导致冠状动脉内腔口径减小，和/或血小板聚集引起微血管间歇性阻塞时，可能发生心肌缺血。气球血管成形术常用于因斑块而变窄的血管的再开。虽然气球血管成形术在打开血管的情况中成功率很高，但是它常常在手术过程中使内皮裸露并损伤血管。这种损伤引起血管平滑肌细胞迁移至损伤部位并增殖，形成病灶，称为肌内膜增生或再狭窄。这一新病灶导致在血管成形术后3-6个月内有显著比例的患者症状复发。在动脉粥样硬化、血栓症、和再狭窄中，还存在正常血管功能的丧失，使得血管倾向于收缩而非扩张。血管的过度收缩引起血管内腔进一步变窄，从而限制血流。这可以引起诸如心绞痛(如果涉及心动脉)或暂时性脑缺血(即“小中风”，如果涉及脑血管)。在其它疾病状态中也发生这种血管功能异常(血管收缩过度或血管扩张不足)。高血压是由血管过度收缩以及血管壁变厚(特别是较小的血管)引起的。该过程可能影响肺血管并引起肺性高血压。已知与血管收缩过度或血管扩张不足有关的其它病症包括移植性动脉粥样硬化、充血性心力衰竭、妊娠毒血症、Raynaud现象、Prinzmetal心绞痛(冠状动脉血管痉挛)、脑血管痉挛、溶血性尿毒症、和性无能。由内皮释放的物质，最初称为“内皮衍生的松弛因子”(EDRF)，在抑制这些病理性过程中具有重要作用。现在已知EDRF就是一氧化氮(NO)。NO在人的生理学中具有许多作用，包括松弛血管平滑肌、抑制血小板聚集、抑制有丝分裂、使血管平滑肌增殖、和粘附白细胞。因为NO是最具潜力的内源性血管扩张剂，因为它在运动诱导的导管性动脉血管舒张中起主要作用，所以增强NO合成也可以提高正常个体和血管病患者的运动能力。内皮一氧化氮合酶(eNOS)是对维持全身血压、血管改造、和血管发生起作用的一氧化氮合酶(NOS)异构体(Shesely等人，1996；Huang等人，1995；Rudic等人，1998；Murohara等人，1998)。因为内皮生成的NO不足是动脉粥样硬化和血管损伤的早期而持续的特征，所以经证明，eNOS是血管基因治疗中极有吸引力的靶。虽然eNOS激活的调控机制大部分还不清楚，但eNOS应答多种形式的细胞刺激而发生磷酸化是已知的(Michel等人，1993；Garcia-Cardena等人，1996；Corson等人，1996)，但是磷酸化在一氧化氮(NO)生成中的作用和负责的激酶以前未有阐述。专利技术概述本专利技术部分产生于新发现丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Akt(蛋白激酶B)可以直接使eNOS中对应于牛eNOS第1179位残基或人eNOS第1177位残基的丝氨酸残基发生磷酸化并激活eNOS导致生成NO。突变型eNOS(S1179A或S1177A)对Akt磷酸化和激活有抗性，而突变型eNOS(S1179D或S1177D)或(S1179E或S1177E)是具有组成活性的。此外，使用腺病毒介导的基因转移，激活的Akt增强从内皮细胞释放基础NO，而激活缺陷的Akt减少由VEGF刺激的NO生成。因此，eNOS是新描述的Akt底物，这一底物通过Akt将信号转导与气体第二信使NO的释放相联系。本专利技术部分还基于这两发现突变型eNOS(S1179D)展示能增高NO生成速率和增强还原酶的活性。本专利技术包括NOS多肽或蛋白质及其分离的编码核酸分子，其中NOS多肽或蛋白质包含对应于牛eNOS第1179位残基、人eNOS第1177位残基、大鼠nNOS第1412位残基、或人nNOS第1415位残基的替代氨基酸残基。优选的替代包括R基团带负电的氨基酸，包括天冬氨酸和谷氨酸。本专利技术还包括NOS多肽或蛋白质及其分离的编码核酸分子，其中NOS多肽或蛋白质包括对应于牛eNOS第1179位残基、人eNOS第1177位残基、大鼠nNOS第1412位残基、或人nNOS第1415位残基的替代氨基酸残基。优选的替代包括R基团不带负电的氨基酸，诸如丙氨酸。本专利技术提供了用于在内源血管发生有缺陷的局部缺血性疾病(尤其是外周血管疾病和/或心肌缺血)患者中刺激侧副血管发育的方法，包括递送编码本专利技术NOS多肽或Akt多肽的转化基因。本专利技术还包括表达本专利技术NOS多肽的非人转基因动物。最后，本专利技术包括用于鉴定调节受Akt调控的NOS活性的试剂的方法，一般包括步骤(a)将试剂与纯化的NOS(优选eNOS或nNOS)或者表达NOS(优选eNOS或nNOS)的细胞，以及Akt接触；并(b)测量受Akt调控的NOS(优选eNOS或nNOS)活性。图的简述附图说明图1A-1B。是野生型的Akt，而非无激酶活性的Akt增加了由表达膜相关eNOS的细胞释放的NO。在图1A中，在不存在或存在Akt或无激酶活性的Akt(K179M)的情况下用eNOS的质粒转染COS细胞，通过化学发光测定NO产量(以NO2-测定)。在图1B中，用如上的各种NOS质粒转染COS细胞。在图1A和图1B中，从只用β-半乳糖苷酶转染的细胞获得的水平减去NO2-产量。插图显示了总细胞裂解物中的蛋白质表达。数据是平均值±SEM，n＝3-7次实验；*表示p＜0.05。图2A-2D。由有活性的Akt在体外和体内进行的eNOS磷酸化。在图2A中，用HA-Akt或HA-Akt(K179M)转染COS细胞，免疫沉淀裂解物，并与作为底物的组蛋白2B(25mg)或重组eNOS(3mg)一起置于体外激酶反应中。上面的图描绘了底物中掺入的32P，下面的图显示了考马斯染色的凝胶中底物的量。在图2B中，从转染的COS细胞亲和纯化32P标记的野生型eNOS或双丝氨酸突变eNOS(eNOS S635/1179)，并进行自显影(上面的图)或Western印迹(下面的图)。图2B中的图形数据反映了凝胶中经标记蛋白质相对于免疫反应性eNOS量的相对量。在图2C中，用胰蛋白酶消化经标记eNOS，并通过RP-HPLC区分肽。上面的层析图记录了一个占优势的经标记胰蛋白酶消化肽，该肽随未标记合成磷肽标准共迁移(下面的层析图)。插图证明了经标记肽(上图)和磷肽标准具有相同的质量-离子的线性模式MS。在图2D中，纯化了重组野生型eNOS或eNOS S1179A，并如上述方法以等量(2.4mg)与重组Akt一本文档来自技高网...

【技术保护点】
编码选自下组的ＮＯＳ多肽的分离的核酸分子：有组成性活性的ＮＯＳ多肽、ＮＯ生成速率增加了的ＮＯＳ多肽、和还原酶活性增加了的ＮＯＳ多肽。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：WC塞萨，
申请(专利权)人：耶鲁大学，
类型：发明
国别省市：US[美国]