使用TGF-β的基因治疗制造技术

本发明专利技术涉及使用属于转化生长因子－β（ＴＧＦ－β）超家族成员的细胞介导的基因治疗，治疗矫形外科疾病。证实了ＴＧＦ－β基因治疗可作为变性关节炎的新疗法。在将ＴＧＦ－β ｃＤＮＡ表达载体转染入成纤维细胞（ＮＩＨ３Ｔ３－ＴＧＦ－β１）后，将该细胞注射入家兔跟腱和具有人为造成的软骨缺损的膝关节中。进行腱内注射来确定其体内表达的最佳浓度。制造了部分缺损软骨模型来模仿膝关节的变性关节炎。新形成的透明软骨覆盖了用细胞－介导的基因治疗方法治疗的部分软骨缺损，表明细胞存活并在该区域内刺激基质形成。完全除去软骨的区域被纤维状胶原覆盖。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

技术介绍
1.专利
本专利技术涉及将编码转化生长因子β超家族成员的至少一种基因引入至少一种哺乳动物结缔组织中，用于哺乳动物宿主中结缔组织再生的方法。本专利技术还涉及一种结缔组织细胞系，它携带一种DNA载体分子，该载体含有编码转化生长因子β超家族成员的基因。2.相关领域的简述在矫形外科领域，变性关节炎或骨关节炎是最常见的伴有软骨损伤的疾病。几乎机体的每个关节，如膝、髋、肩、甚至是腕都会患。该疾病的发病机理是透明关节软骨的变性(Mankin等，J.Bone Joint Surg，52A460-466，1982)。关节的透明软骨变形、形成原纤维，最终凹陷。如果变性的软骨能以某种方式再生，大多数病人将能重新享受生活，而没有令人虚弱的疼痛。迄今尚未报道过能再生损伤透明软骨的方法。药物递送的传统途径(如口服、静脉内或肌肉内给药)对于将药物携带到关节是无效的。关节内注射药物的半衰期通常较短。关节内注射药物的另一个缺点是需要频繁重复注射，以在关节腔获得可接受的药物水平，用于治疗慢性病如关节炎。因为迄今的治疗药物不能选择性的靶向关节，必需使哺乳动物宿主接触全身性高浓度的药物，来实现持续的、关节内治疗剂量。而非靶器官接触高浓度的药物加重了抗关节炎药物产生严重副作用(如哺乳动物宿主的胃肠道不适、和血液学、心血管、肝肾系统的变化)的倾向。在矫形外科领域，已考虑将一些细胞因子作为治疗矫形外科疾病的候选药物。认为骨形态发生蛋白质是骨形成的有效刺激剂(Ozkaynak等，EMBO J，92085-2093，1990；Sampath和Rueger，Complication in Ortho，101-107，1994)，并已报道TGF-β可作为骨发生和软骨形成的刺激剂(Joyce等，J Cell Biology，1102195-2207，1990)。认为转化生长因子-β(TGF-β)是一种多功能细胞因子(Sporn和Roberts，Nature(London)，332217-219，1988)，并在细胞生长、分化和胞外基质蛋白合成中起调节作用(Madri等，J Cell Biology，1061375-1384，1988)。TGF-β在体外抑制表皮细胞和成骨样细胞的生长(Chenu等，Proc.Natl.Acad.Sci，855683-5687，1988)，但它在体内刺激软骨内骨化和最终形成骨(Critchlow等，Bone，521-527，1995；Lind等，A Orthop Scand 64(5)553-556，1993；和Matsumoto等，In vivo，8215-220，1994)。TGF-β诱导的骨形成是通过它对骨膜下多能细胞的刺激所介导的，这些细胞最终分化成软骨细胞(Joyce等，J Cell Biology，1102195-2207，1990；和Miettinen等，J Cell Biology，127-62021-2036，1994)。已报道了TGF-β在矫形外科中的生物学作用(Andrew等，Calcif Tissue In.5274-78，1993；Borque等，Int J Dev Biol，37573-579，1993；Carrington等，J Cell Biology，1071969-1975，1988；Lind等，A Orthop Scand.64(5)553-556，1993；Matsumoto等，In vivo 8215-220，1994)。在小鼠胚胎中，染色显示TGF-β与衍生自间充质的组织(如结缔组织、软骨和骨)紧密相关。除了胚胎学的发现外，TGF-β还存在于骨形成和软骨形成部位。它还能增强家兔胫骨骨折愈合。近来，报道了TGF-β的治疗价值(Critchlow等，Bone，521-527，1995；和Lind等，A OrthopScand 64(5)553-556，1993)，但其短期作用和高成本限制了广泛的临床应用。TGF-β关节内注射用于治疗关节炎不理想，因为注射的TGF-β作用持续时间短，因为TGF在体内降解成无活性形式。因此，需要一种长期释放TGF-β的新方法，用于透明软骨再生。报道了自身移植软骨细胞再生关节软骨(Brittberg等，New Engl J Med 331889-895，1994)，但该方法包括两次广泛切除软组织的手术。如果关节内注射足以治疗变性关节炎，这将对病人经济上和生理上有极大的好处。基因治疗是一种将特定蛋白转移到特定部位的方法，它可以解决这个问题(Wolff和Lederberg，Gene Therapeutics，Jon A.Wolff编，3-25，1994；和Jerk，JNatl Cancer Inst，89(16)1182-1184，1997)。美国专利5,858,355和5,766,585公开了制造一种IRAP(白细胞介素-1受体拮抗蛋白)基因的病毒或质粒构建物；用该构建物转染滑膜细胞(5,858,355)和骨髓细胞(5,766,585)；和将转染细胞注射到家兔关节中，但未公开用属于TGF-β超家族的基因再生结缔组织。美国专利号5,846,931和5,700,774公开了注射含有骨形态发生蛋白(BMP)(属于TGFβ“超家族”)和截短的甲状旁腺激素相关肽的组合物，来影响软骨组织形成的维持并诱导软骨组织。然而，未公开使用BMP基因作基因治疗的方法。尽管这些现有技术公开的内容，对于将编码产物的至少一种基因在体外或体内引入哺乳动物宿主结缔组织的至少一种细胞，用于治疗哺乳动物宿主的方法仍然有非常现实和基本的需要。另外，还需要一种方法，即采用编码转化生长因子β超家族成员的一种基因在哺乳动物宿主中再生结缔组织。更具体说，需要一种方法，在体内宿主结缔组织细胞中表达编码蛋白质TGF-β超家族的基因。专利技术简述本专利技术满足了本文上述需要。本专利技术提供了一种将至少一种编码产物的基因引入哺乳动物结缔组织的至少一种细胞中，用于治疗哺乳动物宿主的方法。该方法包括用重组技术产生含有编码该产物的基因的DNA载体分子，并将含有编码该产物的基因的DNA载体分子引入结缔组织细胞中。该DNA载体分子可以是任何能被传递并在靶细胞或组织中维持的DNA分子，从而编码该感兴趣产物的基因能稳定表达。优选用于本专利技术的DNA载体分子是病毒或质粒DNA载体分子。该方法优选包括将编码该产物的基因引入哺乳动物结缔组织的细胞，用于治疗。本专利技术涉及一种治疗关节炎的方法，包括a)产生一种重组病毒或质粒载体，该载体包含编码蛋白质转化生长因子超家族成员的DNA序列，该序列与一启动子可操纵性连接；b)用所述重组载体体外转染培养的结缔组织细胞群，得到一群转染的结缔组织细胞；和c)将转染的结缔组织细胞通过关节内注射移植到哺乳动物宿主的关节腔中，从而该DNA序列在关节腔内的表达导致结缔组织再生。该重组载体可以是但不限于逆转录病毒载体，优选逆转录病毒载体，载体还可以是质粒载体。本专利技术的方法包括在移植前储藏一群转染的结缔组织细胞。细胞可在移植前液氮下储藏在10％DMSO中。结缔组织细胞包括但不限于成纤维细胞、间充质细胞、成骨细胞或软骨细胞。成纤维细胞可以是NIH 3T3细胞或人包皮成纤维细胞。结缔组织包括但不限于软骨、韧带或腱。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种治疗关节炎的方法，其特征在于，该方法包括： ａ）产生一种重组病毒或质粒载体，该载体含有与一启动子可操纵性连接的，编码蛋白质转化生长因子超家族成员的ＤＮＡ序列； ｂ）用所述重组载体体外转染一群培养的结缔组织细胞，得到一群转染的结缔组织细胞；和 ｃ）通过关节内注射将所述转染的结缔组织细胞移植到哺乳动物宿主的关节腔，从而所述ＤＮＡ序列在所述关节腔中的表达导致结缔组织再生。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢文钟，康庚爱，李宽熙，
申请(专利权)人：组织基因公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]