本发明专利技术公开了一种针对人ＯＰＮ基因用于肿瘤基因治疗的短的干扰核糖核酸（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ）。该ｓｉＲＮＡ使用ＲＮＡ干扰技术，通过利用短片断的双链ＲＮＡ促使特定基因的ｍＲＮＡ降解来高效、特异的阻断特定基因的表达，诱使细胞表现出特定基因沉默的表型，被研究人员应用到疾病治疗领域。ＯＰＮ基因表达一种多功能蛋白质，参与人肿瘤发生和转移。它广泛存在于正常成人组织和体液中。我们通过实验证明，抑制ＯＰＮ基因表达之后，肿瘤细胞生长受到明显抑制。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种具有特异性肿瘤治疗的RNA干扰片段制备方法。眾议不RNAi的高度特异性和相对宽松的设计条件，使RNAi不仅可以应用于基因功 能研究，更广泛的，RNAi将被应用到基于基因组序列的核酸药物研究和药物耙标验证中。截止2000年末，共计215个基于基因水平治疗的药物在研，其中87个为基因 治疗药物，62个为DNA疫苗，35个为针对RNA的反义核酸和核酶。具体数据见下 表<table>table see original document page 5</column></row><table>截止2000年底，基于基因组的在研药物分布表由上表可见，RNA攻击核酸制药迄今为止是以反义核酸为主，核酶技术为辅 的一个领域。1997年ISIS制药公司的抗病毒反义核酸药物得到美国医药食品管 理局的批准，为反义核酸药物的发展提供了先例。近年高等动物功能基因组研 究正在以更快的速度为反义核酸药物的发展提供靶基因，使反义核酸药物的适 用范围从癌症向传染病，心血管疾病，炎症及自身免疫等多方面扩张。2001年8 月ISIS将蛋白激酶C的反义核酸药物以2亿美元的高价转让给大制药公司Eli Lilly, 2002年4月，世界第二大反义核酸药物公司Genta将其bc1-2的反义核酸 药物以4. 8亿美元的高价转让给大制药公司Aventis标志了反义核酸药物的发展 走向成熟并进入制药业的主流。这不仅是反义核酸的成功，而更重要的是以RNA 攻击为手段的制药思路和领域的成功。与反义核酸药物相比，siRNA在体外显示 了非常优越的性质。siRNA和非常好的反义核酸对基因的表达抑制都可以达到在 80-90%以七，但筛选这样的siRNA要相对容易的多。而且，达到同样水平的表达 抑制所需的siRNA比反义核酸浓度低10—IOO倍。不仅如此，siRNA对基因表达抑 制的有效时间也比反义核酸有较大的延长(从两天延长到5-7天)。siRNA在体外 显示的这些优越性质，如果能在RNA攻击制药中体现出来，将为着 -领域注入强 大的生命力和价值。从哲学的角度，siRNA这一有效的基因操作手段和RNA攻击这一成熟的制药领域的结合是不可避免的。siRNA—旦进入制药，首先将在病毒性传染病如HIV和癌症如白血病的治疗 方面形成巨大的经济效益。中国在这两个方面有以百亿计的市场，世界在癌症 和病毒性传染病的治疗方面还存在大的空白，siRNA的介入可以产生很好的社会 作用。如果中国在这一领域实现突前发展，对提高中国制药业在加入WTO后的竞 争力有重要意义。吉凯基因早在2002年就开始RNA干扰开发和相关技术研究，针对OPN基因制 备的可以抑制肿瘤细胞生长的siRNA是长期研究的结果之一。
技术实现思路
本专利技术的目的在于利用RNA干扰技术，制备一种可以用于肿瘤基因治疗的核 心分子，这种核心基因治疗分子是以RNA干扰技术作为基础的。 本专利技术的上述目的是通过下述技术方案实现的A. 从genebank中调取human OPN基因序列；B. 利用GeneChem软件预测有效的siRNA位点；C. 合成12个针对0PN基因的siRNA;D. 12个siRNA转染293T细胞；E. RT-PCR检测这些siRNA对OPN基因的mRNA的抑制作用；F. Western检测这些siRNA对OPN基因的蛋白表达水平的抑制作用；G. 筛选mRNA水平和蛋白质水平抑制作用超过90%的siRNA。H. 该siRNA是本权利要求书要求的专利材料。I. 对该siRNA进行LNA化学修饰，增加其稳定性。 J.将该siRNA构建入病毒载体，进行细胞学和动物水平实验研究。 所述的用于肿瘤基因治疗的siRNA (针对human 0PN基因)，其特征在于其序列为5， GCAGCTTTACMCMATACCC3，5' TCTCCTTGCGCCACAGMT3'5， GGACAGTTATGAAACGAGT3，5' GCATTCCGATGTGATTGAT3'5' CCATTCTGATGAATCTGAT3，5， GCCTTATATCGTGATCTGC3'5， GATGCCMCGATTCCTCCT3，5， CTCTTCGGGATTGTTTCCA3，5， ACACCTGAMTTTCGTATT3'5， Tcaggccagttgcagccttct3，5' GTTGTCCAGCMTTMTM3，5， GCATCTTCTGAGGTCMTTA3' 所述的siRNA结构为s画5， p,N隨剛,國國湖,國TT 3，本专利技术的优选方案为所述的用于肿瘤基因治疗的siRNA (针对human 0PN 基因)基于RNA干扰原理；所述的用于肿瘤基因治疗的siRNA (针对human 0PN基因)针对OPN基因； 和传统基因抑制技术相比较，本专利技术具有以下有益效果使用RNA干扰技术， 可以提高对目的基因的特异性，可以提高对目的基因的抑制效率，可以对目的 基因的抑制效率实施不同抑制效率的选择。附闺说明附图说明图1为RNA干扰作用原理图图2为siRNA结构图图3为siRNA制备流程图具体实施方式从genbank调取目的基因信息LOCUSDEFINITIONACCESSION VERS腦 KEYWORDS SOURCE ORGANISMREFERENCE AUTHORSTITLE JOURNAL PUBMED REMARKREFERENCE AUTHORS TTLEJOURNAL PUBMED000582 1616 bp mRNA linearPRI 03-DEC-2006Homo sapiens secreted phosphoprotein 1 (osteopontin, bone sialoprotein I, early T-lymphocyte activation 1) (SPP1), transcript variant 2， . NM—000582—000582.2 GI: 38146097Homo sapiens (human) Homo sapiensEukaryota: Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi; Mammalia; Eutheria; Euarchontoglires; Primates; H即lorrhini; Catarrhini; Hominidae; Homo.1 (bases 1 to 1616)Kita，Y., Natsugoe，S. ， 0kumura， H., Matsumoto, M., Uchikado，Y.,Setoyama, T., Owaki，T. ， Ishigami,S. and Aikou, T.Expression of osteopontin in oesophageal squamous cell carcinomaBr. J. Cancer 95 (5)， 634-638 (2006)16880782GeneRIF: The evaluation of Osteopontin expression is useful for predic本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种针对人ＯＰＮ基因用于肿瘤基因治疗的短的干扰核糖核酸（ｓｈｏｒｔｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ）。制备方法包括如下步骤：Ａ．从ｇｅｎｅｂａｎｋ中调取ｈｕｍａｎＯＰＮ基因序列；Ｂ．利用ＧｅｎｅＣｈｅｍ软 件预测有效的ｓｉＲＮＡ位点；Ｃ．合成１２个针对ＯＰＮ基因的ｓｉＲＮＡ；Ｄ．１２个ｓｉＲＮＡ转染２９３Ｔ细胞；Ｅ．ＲＴ－ＰＣＲ检测这些ｓｉＲＮＡ对ＯＰＮ基因的ｍＲＮＡ的抑制作用；Ｆ．Ｗｅｓｔｅｒｎ检测这些ｓｉＲ ＮＡ对ＯＰＮ基因的蛋白表达水平的抑制作用；Ｇ．筛选ｍＲＮＡ水平和蛋白质水平抑制作用超过９０％的ｓｉＲＮＡ。Ｈ．该ｓｉＲＮＡ是本权利要求书要求的专利材料。Ｉ．对该ｓｉＲＮＡ进行ＬＮＡ化学修饰，增加其稳定性。Ｊ． 将该ｓｉＲＮＡ构建入病毒载体，进行细胞学和动物水平实验研究。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：曹跃琼，
申请(专利权)人：上海吉凯基因化学技术有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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