多联免疫粘附制造技术

本发明专利技术公开了包含两个可溶性结构域的多联蛋白，其中生物活性蛋白的一个可溶性结构域的Ｃ末端与生物活性蛋白的相同可溶性结构域或不同可溶性结构域的Ｎ末端相连。另外，本发明专利技术还公开了二聚蛋白，其通过在两个单体蛋白的铰链区形成分子间二硫键而形成，所述单体蛋白是通过将参与免疫应答的蛋白的两个相同可溶性胞外结构域的多联体与免疫球蛋白Ｆｃ片段相连而形成，还公开了二聚蛋白的糖基化蛋白，编码该单体蛋白的ＤＮＡ构建体，含有该ＤＮＡ构建体的重组表达质粒，由该重组表达质粒所转化的或转染的宿主细胞，以及通过培养该宿主细胞制备该二聚蛋白的方法。另外，本发明专利技术还公开了包含该二聚蛋白或其糖基化形式的药物或诊断组合物。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及多联蛋白(concatameric proteins)，更具体地涉及生物活性蛋白结构域的多联结构，其中生物活性蛋白的胞外可溶性结构域C末端与生物活性蛋白的相同或其它胞外可溶性结构域N末端相融合，以及两个多联体通过与免疫球蛋白Fc片段铰链区相偶联而形成二聚体，以及多联蛋白的糖基化形式。
技术介绍
细胞因子的活性与针对各种抗原刺激的炎症和/或免疫应答的病理严重程度相关。目前，许多能够识别细胞因子的抗原特异性抗体和可溶性受体都被用于抑制细胞因子的功能，以达到治疗目的(WO93/016184，WO96/02576，WO96/023067，WO1997/03682，和US5,434,131，5,656,272，5,977,318，6,210,661，6,225,117)。抗体和可溶性受体是通过干扰细胞因子和细胞表面上细胞因子受体之间的相互作用而抑制细胞因子的信号转导。Capon等人公开了将可溶性受体用作细胞因子的功能抑制剂，该可溶性受体与人免疫球蛋白的重链相融合(Nature 3375254，1989)，此后，公开许多专利，这些专利技术均涉及可溶性受体与免疫球蛋白的融合蛋白(US专利5,521,288，5,844,095，6,046,310，6,090,914，6,100,383，6,225,448)。通常，可溶性受体和免疫球蛋白的融合蛋白具有下述优点(Capon等，Nature 3375254，1989)1.通过二聚化形成二价而增加对配体的总体亲合力2.延长蛋白的血液半衰期，也就是提高了分子稳定性3.通过免疫球蛋白重链Fc片段激活效应细胞4.可利用亲和柱如利用蛋白A简便地纯化多数受体胞外结构域和免疫球蛋白重链的融合蛋白由不含CH1结构域的重链组成，这样二聚体就不会与轻链结合。对于参与免疫应答的蛋白和受体的功能，更加期望利用该结构。例如，WO94/06476和US 5,447,851中公开的TNFR(WO92/16221，WO95/34326)-免疫球蛋白融合蛋白已被用于抑制TNF-介导的炎症。众所周知，TNFR-免疫球蛋白融合蛋白比原始的单体分子具有更高的亲合性(Lesslauer等，Eur.J.Immunol.212883，1991；Ashkenazi等，Proc.Natl.Acad.Sci.8810535，1991；Peppe等，J.Exp.Med.1741483，1991；Mohler等，J.Immunol.1511548，1993)。为增强对TNF介导的反应的抑制，可通过TNFR，CD2和CTLA-4的可溶性胞外结构域的多聚化来提高效力。例如，当将分别与免疫球蛋白重链(重链融合蛋白)及轻链(轻链融合蛋白)相结合的TNFR胞外结构域的融合蛋白在相同细胞内共表达时，通过重链与重链和轻链相连，我们可以得到四聚体形式的融合蛋白。如Scallon等所示，该四聚体显示出比单体或二聚体形式强得多的效力(Cytokine 7759，1995)。但是，该方法用于商业应用还存在许多困难，例如在相同细胞系内同时表达两种不同的融合蛋白，多聚体形式的产量极低；难以纯化高分子量的多聚体形式。因此，目前所用的免疫球蛋白融合蛋白仅为重链融合形式。所以，非常渴望发展产量高、纯化效力高的生产多聚蛋白治疗剂的方法。
技术实现思路
本专利技术人利用DNA重组技术，通过将生物活性蛋白可溶性结构域的C末端与相同或其它生物活性蛋白的可溶性结构域N末端相融合，从而制得了多联蛋白。另外，本专利技术人通过将其与免疫球蛋白Fc片段的铰链区相连而使该多联体成为二聚体，并使用DNA诱变技术而加入更多糖基化。本专利技术人还发现多联蛋白二聚体及其糖基化形式比常规的单体融合蛋白显示出更高的效力和稳定性。因此，本专利技术一方面提供多联蛋白，其中生物活性蛋白可溶性结构域的C末端与相同或其它生物活性蛋白可溶性结构域的N末端相融合。另一方面，本专利技术还提供二聚体蛋白，其由两个单体蛋白通过铰链区的二硫键连接而成，所述单体蛋白的多联部分与免疫球蛋白Fc片段的铰链区相融合。本专利技术还提供编码单体融合蛋白的DNA构建体，所述单体融合蛋白的多联结构域与免疫球蛋白Fc片段的铰链区相融合。本专利技术还提供含有编码单体融合蛋白的DNA构建体的DNA质粒，所述单体融合蛋白的多联部分与免疫球蛋白Fc片段的铰链区相融合。本专利技术还提供由重组DNA质粒所转染或转化的宿主细胞，所述质粒包括编码单体融合蛋白的DNA构建体，所述单体融合蛋白的多联部分与免疫球蛋白Fc片段的铰链区融合。本专利技术还提供一种方法用于培养宿主细胞，该宿主细胞用重组DNA质粒转染或转化，所述质粒包括编码单体融合蛋白的DNA构建体，所述单体融合蛋白的多联部分与免疫球蛋白Fc片段的铰链区相融合，所述培养在适于表达DNA构建体的条件下进行，所述构建体编码与免疫球蛋白Fc片段的铰链区偶联的多联融合蛋白，并生产二聚多联体，所述二聚多联体是通过如上所述的两个单体多联体在铰链区的二硫键相连而形成，包括从细胞培养物中纯化上述蛋白的过程。本专利技术还提供在适于表达DNA构建体的最佳条件下，所述DNA构建体编码单体融合蛋白，该单体融合蛋白的免疫功能的多联部分与免疫球蛋白Fc片段的铰链区相融合，培养宿主细胞的方法，该宿主细胞用重组DNA质粒转染或转化，所述质粒包含编码单体融合蛋白的DNA构建体，所述单体融合蛋白的免疫调节功能的多联部分与免疫球蛋白Fc片段的铰链区相融合，并且其中插入了糖基化基序，还提供生产糖基化二聚体的方法，该二聚体是通过如上所述的两个单体蛋白的铰链区的二硫键相连而成，包括从细胞培养物中纯化上述糖基化蛋白的过程。本专利技术另一方面还提供用于将糖基化基序插入编码单体融合蛋白的DNA构建体中的DNA引物，所述单体融合蛋白的多联部分与免疫球蛋白Fc片段的铰链区相融合。本专利技术还提供糖基化二聚体，该二聚体是通过两个单体蛋白在铰链区的二硫键相连而成，所述单体蛋白中参与免疫应答的多联部分与免疫球蛋白Fc片段的铰链区相融合。本专利技术还提供含有药学有效量的二聚体以及药学可接受载体的药物组合物，所述二聚体通过两个单体融合蛋白在铰链区的二硫键而形成，所述单体蛋白中参与免疫应答的多联部分与免疫球蛋白Fc片段的铰链区相融合。本专利技术还提供含有药学有效量的糖基化二聚体以及药学可接受载体的药物组合物，所述糖基化二聚体通过两个单体蛋白在铰链区的二硫键而形成，所述单体蛋白中参与免疫应答的多联部分与免疫球蛋白Fc片段的铰链区相融合。附图说明通过以下具体的描述并结合附图，可更加清楚地理解本专利技术上述目的和其它目的，特征和其它优点，附图为图1显示利用聚合酶链式反应(PCR)制备DNA构建体的方法示意图，该构建体编码常规简单融合单体蛋白；图2显示利用PCR制备DNA构建体的方法示意图，该构建体编码本专利技术的多联融合单体蛋白；图3a显示2，2或2融合蛋白的结构，这些都是在细胞中利用TNFR/Fc，CD2/Fc或CTLA4/Fc融合蛋白的同二聚反应而形成的简单融合二聚蛋白，作为常规简单融合单体蛋白的实例。图3b显示2，2或2融合蛋白的结构，这些都是在细胞中利用TNFR-TNFR/Fc，CD2-CD2/Fc或CTLA4-CTLA4/Fc融合蛋白的同二聚反应而形成的多联融合二聚蛋白，作为本专利技术多联融合二聚蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含两个可溶性结构域的多联蛋白，其中生物活性蛋白的一个可溶性结构域的Ｎ末端与生物活性蛋白的相同可溶性结构域或不同可溶性结构域的Ｃ末端相连。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：郑用勳，韩志雄，李惠子，崔恩英，金真美，
申请(专利权)人：梅德克斯金株式会社，
类型：发明
国别省市：KR[韩国]