本发明专利技术涉及一种糖基化免疫球蛋白或其片段以及一种对糖基化免疫球蛋白或其片段进行编码的基因，其中，将含有一种或多种氨基酸修饰的免疫球蛋白变异体额外地糖基化，所述氨基酸修饰选自由Ｍ１６０Ｎ、Ａ１９５Ｎ、Ｔ２４３Ｎ、Ｅ２６５Ｎ、Ｙ２９９Ｔ、Ｆ３３１Ｔ和Ｑ３４６Ｎ所组成的群组。而且，本发明专利技术涉及一种糖基化融合蛋白，其通过将（ａ）一种糖基化免疫球蛋白或其片段与（ｂ）至少一种生物活性蛋白或其一部分链接而形成，其中，将具有已修饰的氨基酸序列以形成一个或多个Ａｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ序列的免疫球蛋白变异体额外地糖基化；一种对糖基化融合蛋白进行编码的基因；一种含有该基因的重组表达载体；一种使用该重组表达载体转化或转染的宿主细胞；一种制备糖基化融合蛋白的方法，其包括培养转化子或转染子以及将该糖基化融合蛋白从培养物中分离出来；以及一种含有如此制备的糖基化融合蛋白的医药组合物。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种糖基化免疫球蛋白以及一种含有糖基化免疫球蛋白的免疫粘附素。更具体地说，本专利技术涉及一种免疫球蛋白或其片段，其通过修饰特定的氨基酸残基而额外地糖基化，以及一种糖基化融合蛋白，其通过将糖基化免疫球蛋白或其片段与至少一种生物活性蛋白或其一部分链接而形成。
技术介绍
免疫粘附素(或免疫球蛋白融合蛋白)是类似抗体的分子，其通过将免疫球蛋白的片段(例如，Fc部分)与受体的配体结合区或粘附分子融合而形成。本领域已知的典型免疫粘附素具有抗体结构，其中，以受体的配体结合区取代参与抗原识别的可变区，同时保留Fc部分。长期以来，已有大量的专利说明了融合蛋白，其中，将生理活性蛋白的特定区域链接到抗体上(美国专利第5,521,288、5,844,095、6,046,310、6,090,914、6,100,383和6,225,448号)。与不含免疫球蛋白的分子相比，免疫粘附素具有以下优点1)融合蛋白对配体的总亲合力增加，因为其具有二聚物形式的二价；2)由于分子稳定性增加，融合蛋白以未受破坏的形式更长时间地存在于血清中；3)通过免疫球蛋白重链的Fc(可结晶片段)部分来活化效应细胞；以及4)通过方便的方法来分离和纯化融合蛋白，例如，使用蛋白质A。例如，如果以肿瘤坏死因子(以下简称“TNF”)作为细胞因子，为了抑制与TNF有关的炎症反应，可以使用肿瘤坏死因子受体(以下简称“TNFR”)，如PCT申请公开第WO92/16221和WO95/34326号中所述，或者可以使用TNFR-免疫球蛋白(Ig)融合蛋白，如美国专利第5,447,851号以及PCT申请公开第WO94/06476号中所述。根据许多报告，TNFR-Ig融合蛋白对TNF的亲合力比TNFR的天然单体形式或非Ig融合形式要高得多(Lesslauer W.等人，Eur.J.Immunol.，1991年，第21卷，第2883页；Ashkenazi A.等人，PNAS USA，1991年，第88卷，第10535页；Peppel K.等人，J.Exp.Med.，1991年，第174卷，第1483页；MohlerK.M.等人，J.Immunol，1993年，第151卷，第1548页)。对于使用Ig融合蛋白来抑制TNF作用或控制免疫反应的情况，Ig融合结构中作为TNF受体、CD2和CTLA4的功能区的细胞外区的多价或多聚物形式预计可以提高融合结构的功效。当TNF受体细胞外区和Ig重链的一种单体融合蛋白(重链融合蛋白)与TNF受体细胞外区和Ig轻链的另一种单体融合蛋白(轻链融合蛋白)同时在一个细胞系中表达时，通过重链和轻链之间的相互作用来产生二聚融合蛋白。二聚融合蛋白具有像活体内形式那样平行排列的两个有效区，并且与单体融合结构相比，具有显著提高的功效(Scallon BJ.等人，Cytokine，1995年，第7卷，第759页)。但是，由于以下问题，这种二聚物形式的Ig融合蛋白难以工业化应将单独融合至Ig重链和轻链的两个基因共同引入宿主细胞；当在单个细胞中同时表达两种不同的融合蛋白时，其产率极大地降低；而且，由于并非所有表达的重链融合蛋白和轻链融合蛋白都参与二聚物的形成，因此融合重链融合蛋白和轻链融合蛋白的二聚物在技术上难以从与单体重链融合蛋白或轻链融合蛋白的混合物中分离出来。在这方面，本专利技术人构建了一种串联体蛋白，其中，使用重组DNA技术将生物活性蛋白的可溶区的C-末端链接到相同或不同生物活性蛋白的可溶区的N-末端。而且，本专利技术人制备了一种对二聚蛋白进行编码的DNA结构，其中，单体蛋白的两个分子(其中，将参与免疫反应的蛋白的串联体链接到免疫球蛋白Fc片段的铰链区)在铰链区二硫化键结，并根据DNA结构使用重组DNA技术产生串联体链接的二聚融合蛋白。如上所述，已经尝试改进免疫球蛋白融合蛋白的功效和制备方法，但几乎所有努力都未能增加免疫球蛋白融合蛋白的稳定性。在这方面，如韩国专利申请第2002-0045921号中所述，本专利技术人提出了一种通过将糖基化基序添加到蛋白的功能区与免疫球蛋白Fc区之间的连接区域来增加蛋白稳定性的方法。但是，当在功能区附近糖基化免疫粘附素时，蛋白无法正确折叠或者降低了功能。
技术实现思路
在这方面，本专利技术人通过将额外的糖基化基序引入免疫球蛋白融合蛋白的免疫球蛋白(特别是Fc部分)而构建了一种糖基化融合蛋白，并且发现，该糖基化融合蛋白在活体内的作用时间比不含糖基化基序的形式更长，从而得到了本专利技术。因此，一方面，本专利技术提供了一种糖基化免疫球蛋白或其片段，其中，将含有一种或多种氨基酸修饰的免疫球蛋白变异体额外地糖基化，所述氨基酸修饰选自由M160N、A195N、T243N、E265N、Y299T、F331T和Q346N所组成的群组。另一方面，本专利技术提供了一种对糖基化免疫球蛋白或其片段进行编码的DNA，其中，将含有一种或多种氨基酸修饰的免疫球蛋白变异体额外地糖基化，所述氨基酸修饰选自由M160N、A195N、T243N、E265N、Y299T、F331T和Q346N所组成的群组。又一方面，本专利技术提供了一种糖基化融合蛋白，其通过将(a)糖基化免疫球蛋白或其片段与(b)至少一种生物活性蛋白或其一部分链接而形成，其中，将具有已修饰的氨基酸序列以形成一个或多个Asn-X-Ser/Thr序列的免疫球蛋白变异体额外地糖基化。另一方面，本专利技术提供了一种对糖基化融合蛋白进行编码的DNA分子，所述糖基化融合蛋白通过将(a)糖基化免疫球蛋白或其片段与(b)至少一种生物活性蛋白或其一部分链接而形成，其中，将具有已修饰的氨基酸序列以形成一个或多个Asn-X-Ser/Thr序列的免疫球蛋白变异体额外地糖基化。另一方面，本专利技术提供了一种重组表达载体，其含有对糖基化融合蛋白进行编码的DNA分子，所述糖基化融合蛋白通过将(a)糖基化免疫球蛋白或其片段与(b)至少一种生物活性蛋白或其一部分链接而形成，其中，将具有已修饰的氨基酸序列以形成一个或多个Asn-X-Ser/Thr序列的免疫球蛋白变异体额外地糖基化。另一方面，本专利技术提供了一种使用重组表达载体转染或转化的宿主细胞，所述重组表达载体含有对糖基化融合蛋白进行编码的DNA分子，所述糖基化融合蛋白通过将(a)糖基化免疫球蛋白或其片段与(b)至少一种生物活性蛋白或其一部分链接而形成，其中，将具有已修饰的氨基酸序列以形成一个或多个Asn-X-Ser/Thr序列的免疫球蛋白变异体额外地糖基化。另一方面，本专利技术提供了一种制备糖基化融合蛋白的方法，其包括培养一种宿主细胞，所述宿主细胞使用重组表达载体转染或转化，所述重组表达载体含有对糖基化融合蛋白进行编码的DNA分子，所述糖基化融合蛋白通过将(a)糖基化免疫球蛋白或其片段与(b)至少一种生物活性蛋白或其一部分链接而形成，其中，将具有已修饰的氨基酸序列以形成一个或多个Asn-X-Ser/Thr序列的免疫球蛋白变异体额外地糖基化；以及将糖基化融合蛋白从培养物中分离出来。另一方面，本专利技术提供了一种含有糖基化融合蛋白的医药组合物，所述糖基化融合蛋白通过将(a)糖基化免疫球蛋白或其片段与(b)至少一种生物活性蛋白或其一部分链接而形成，其中，将具有已修饰的氨基酸序列以形成一个或多个Asn-X-Ser/Thr序列的免疫本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种糖基化免疫球蛋白或其片段，其中，将含有一种或多种氨基酸修饰的免疫球蛋白变异体额外地糖基化，所述氨基酸修饰选自由Ｍ１６０Ｎ、Ａ１９５Ｎ、Ｔ２４３Ｎ、Ｅ２６５Ｎ、Ｙ２９９Ｔ、Ｆ３３１Ｔ和Ｑ３４６Ｎ所组成的群组。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑用勋，李基完，赵勋埴，朴洪圭，金光成，
申请(专利权)人：魅德秀专有限公社，
类型：发明
国别省市：KR[韩国]
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