改进的免疫测定方法技术

本发明专利技术一般性地涉及抗体检测领域，并且特别涉及用于检测包含患者体液之样品中的抗体的测定。本发明专利技术提供了检测包含来自哺乳动物对象之体液的测试样品中的抗体的方法，其中使所述测试样品与多个不同量的对所述抗体具有特异性的抗原接触，检测所述抗体与所述抗原之间特异性结合的量，并且基于所述抗体与所述抗原之间特异性结合的量以及由所使用的每个抗原量特异性结合量相对于抗原量的曲线产生的二次曲线参数确定抗体的存在与否。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】改进的免疫测定方法
本专利技术一般性地涉及抗体检测领域，并且特别涉及用于检测包含患者体液之样品中的抗体的测定。
技术介绍
许多诊断、预后和/或监测测定依赖于检测特定疾病状态或疾病易感性的生物标志物。这样的生物标志物通常是作为特定疾病的特征或与疾病易感性相关的蛋白质或多肽。近年来显然抗体(特别是自身抗体)也可充当疾病或疾病易感性的生物标志物。自身抗体是天然存在的抗体，其针对被个体免疫系统识别为外源的抗原(尽管该抗原实际上来源于该个体)。它们可以作为循环的游离自身抗体或者以循环免疫复合物的形式存在于循环中，所述循环免疫复合物由与其靶蛋白结合的自身抗体组成。在一些情况下，由“正常”细胞表达的野生型蛋白质与由疾病细胞或在疾病过程中产生的变异形式的蛋白质之间的差异导致个体的免疫系统将所述变异蛋白质识别为“非自身的”，并因此在该个体中引发免疫应答。这可以是体液(即B细胞介导的)免疫应答，导致产生对于该变异蛋白质具有免疫特异性的自身抗体。WO99/58978描述了用于检测/诊断癌症的方法，所述方法基于评估个体对两种或更多种不同肿瘤标志物的免疫应答。这些方法通常涉及以下步骤：将取自个体的体液样品与一组两种或更多种不同的肿瘤标志物抗原接触，每种肿瘤标志物抗原来自不同的肿瘤标志物蛋白；并检测与对该肿瘤标志物蛋白具有免疫特异性的循环自身抗体结合的所述肿瘤标志物抗原复合物的形成。将这种循环自身抗体的存在作为癌症存在的指示。根据自身抗体产生来测量个体对肿瘤标志物蛋白存在的免疫应答的测定为直接测量或检测体液中的肿瘤标志物蛋白提供了替代方案。这样的测定基本上构成了对肿瘤标志物蛋白存在的间接检测。免疫应答的性质意味着很可能自身抗体可被非常少量的循环肿瘤标志物蛋白引发，因而依赖于检测对肿瘤标志物的免疫应答的间接方法将比用于直接测量体液中肿瘤标志物的方法更加灵敏。因此，基于自身抗体检测的测定方法在疾病过程的早期可能特别有价值，并且还可能涉及筛选无症状患者，例如在筛选中在无症状个体群体中鉴定处于发生疾病“风险”的个体，在无症状个体群体中鉴定已经发生疾病的个体。此外，基于自身抗体检测的方法在疾病过程的早期可能特别有价值，并且还可以用于在有症状个体群体中鉴定已经发生疾病的个体。此外，它们可用于复发性疾病的早期检测。所述测定方法也可在选择或监测疾病的治疗中有价值。除了指示癌症疾病状态，抗体和自身抗体还可以充当其他疾病状态或疾病易感性的生物标志物，其中类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(systemiclupuserythematous，SLE)、原发性胆汁性肝硬化(primarybiliarycirrhosis，PBC)、自身免疫性甲状腺炎(例如，桥本甲状腺炎)、自身免疫性胃炎(例如，恶性贫血)、自身免疫性肾上腺炎(例如，艾迪生病，Addison’sdisease)、自身免疫性甲状旁腺功能减退、自身免疫性糖尿病(例如，1型糖尿病)、重症肌无力、副肿瘤性神经障碍(paraneoplasticneurologicaldisorder)例如兰伯特-伊顿肌无力综合征(Lambert-EatonMyasthenicSyndrome)、炎性肠病、结节病和自身免疫性肝炎只是所述疾病的一些实例。先前认识到，当在诊断或预后中使用基于抗体检测的测定来评估个体在群体内的疾病状态、疾病进展或疾病易感性时，在设计适合于待筛选对象整个群体的标准化测定方法中可能出现困难，因为抗体存在的绝对量在个体之间显著变化。这可能产生高发生率的假阴性结果，例如在具有低抗体量的个体中。类似地，在对真阳性结果评分的方面存在困难，因为抗体的绝对量在个体之间的变化意味着难以为筛选的群体内所有个体的阳性测定结果设置合适的阈值。在WO2006/126008中确定了可以通过包括抗原滴定步骤显著改善测定的性能，更尤其改善其临床效用和可靠性所述测定基于检测作为疾病生物标志物的抗体(特别是自身抗体)。通过测试怀疑含有针对一系列不同量抗原的抗体的样品并构建滴定曲线，可以不依赖于样品中所存在的抗体绝对量而可靠地鉴定真阳性筛选结果。这样的方法与之前的方法相反，之前的方法仅滴定抗原来构建校准曲线或以允许鉴定待用于检测实际患者样品中抗体的最合适的抗原浓度。在这些方法中，仅给出了单点测量以用于实际诊断。因此，这些方法不允许待检测抗体的量在个体之间的变化，这导致如上所述的假阳性和假阴性的发生。WO2006/126008的抗原滴定方法提供了比在单一抗原浓度下测量自身抗体反应性，或滴定血清样品而不是抗原之方法更高的特异性和灵敏度。
技术实现思路
已经确定WO2006/126008中描述的抗原滴定方法提供了对于检测肺癌约40％的灵敏度和约90％的特异性。因此，约10％的测试的健康患者具有阳性结果，但并不呈现疾病状态(假阳性)。由于群体中肺癌的低发生率，阳性预测值(PositivePredictiveValue，PPV，是真阳性而不是假阳性之阳性结果的比例)主要由测定的特异性驱动。因此，提高特异性，即减少假阳性结果的数量是有利的。考虑到这一点，已经令人惊讶地确定，可以通过评估抗原/抗体结合的量和二次曲线参数(secondarycurveparameter)来改善抗原滴定测试方法的特异性。该方法在本文中将被称为“双重截止方法(doublecut-offmethod)”。该方法需要评估抗体与抗原之间的特异性结合水平，以及评估二次曲线参数，只有当测试结果与这两种测量值的截止点相比被分类为阳性时，测试结果才被认为是阳性。根据本专利技术的第一方面，提供了检测包含来自哺乳动物对象之体液的测试样品中的抗体的方法，所述方法包括以下步骤：(a)使所述测试样品与多个不同量的对所述抗体具有特异性的抗原接触；(b)检测所述抗体与所述抗原之间特异性结合的量；(c)对步骤(a)中使用的每个抗原量，绘制或计算所述特异性结合量相对于抗原量的曲线；(d)从在步骤(c)中绘制或计算的所述曲线计算二次曲线参数；以及(e)基于以下组合确定所述抗体的存在与否：(i)在步骤(b)中确定的所述抗体与所述抗原之间的特异性结合的量；和(ii)在步骤(d)中确定的所述二次曲线参数。根据本专利技术的第二方面，提供了在包含来自哺乳动物对象之体液的测试样品中检测两种或更多种抗体的方法，所述方法包括以下步骤：(a)使所述测试样品与包含两个或更多个抗原集的组接触，其中所述组中的每个所述抗原对所述两种或更多种抗体中的至少一种具有特异性；(b)检测与存在于所述测试样品中的抗体结合的所述抗原的复合物；(c)对于每种抗原，对步骤(a)中使用的每个抗原量，绘制或计算所述特异性结合量相对于抗原量的各自的曲线；(d)计算在步骤(c)中绘制或计算的每个曲线的二次曲线参数；以及(e)对于在步骤(c)中绘制或计算的每个曲线，基于以下组合确定所述两种或更多种抗体的存在与否：(i)在步骤(b)中确定的所述抗体与所述抗原之间的特异性结合的量；和(ii)在步骤(d)中确定的所述二次曲线参数。在本专利技术的所有方面，所述哺乳动物对象优选是人。在本专利技术的所有方面，优选对包含从哺乳动物对象获得或制备之体液的测试样品体外进行所述方法。本专利技术在其所有方面的一个关键特征是二次曲线参数的确定和这样的发现：与仅基于测试样品中抗体之间的特异性结本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测包含来自哺乳动物对象之体液的测试样品中的抗体的方法，所述方法包括以下步骤：(a)使所述测试样品与多个不同量的对所述抗体具有特异性的抗原接触；(b)检测所述抗体与所述抗原之间特异性结合的量；(c)对步骤(a)中使用的每个抗原量，绘制或计算所述特异性结合量相对于抗原量的曲线；(d)从在步骤(c)中绘制或计算的所述曲线计算二次曲线参数；以及(e)基于以下组合确定所述抗体的存在与否：(i)在步骤(b)中确定的所述抗体与所述抗原之间的特异性结合的量；和(ii)在步骤(d)中确定的所述二次曲线参数。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.06.20 GB 1411060.51.检测包含来自哺乳动物对象之体液的测试样品中的抗体的方法，所述方法包括以下步骤：(a)使所述测试样品与多个不同量的对所述抗体具有特异性的抗原接触；(b)检测所述抗体与所述抗原之间特异性结合的量；(c)对步骤(a)中使用的每个抗原量，绘制或计算所述特异性结合量相对于抗原量的曲线；(d)从在步骤(c)中绘制或计算的所述曲线计算二次曲线参数；以及(e)基于以下组合确定所述抗体的存在与否：(i)在步骤(b)中确定的所述抗体与所述抗原之间的特异性结合的量；和(ii)在步骤(d)中确定的所述二次曲线参数。2.检测包含来自哺乳动物对象之体液的测试样品中的两种或更多种抗体的方法，所述方法包括以下步骤：(a)使所述测试样品与包含两个或更多个抗原集的组接触，其中所述组中的每种所述抗原对所述两种或更多种抗体中的至少一种具有特异性；(b)检测与存在于所述测试样品中的抗体结合的所述抗原的复合物；(c)对于每种抗原，对步骤(a)中使用的每个抗原量绘制或计算所述特异性结合量相对于所述抗原量的各自的曲线；(d)计算步骤(c)中绘制或计算的每个曲线的二次曲线参数；以及(e)对于在步骤(c)中绘制或计算的每个曲线，基于以下组合确定所述两种或更多种抗体的存在与否：(i)在步骤(b)中确定的所述抗体与所述抗原之间的特异性结合的量；和(ii)在步骤(d)中确定的所述二次曲线参数。3.权利要求2所述的方法，其中所述组的所述两种或更多种抗原是不同的抗原。4.权利要求3所述的方法，其中所述组包含一种或更多种所述不同抗原的两种或更多种抗原变体。5.权利要求2所述的方法，其中所述组的所述两种或更多种抗原是抗原变体。6.权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述二次曲线参数选自斜率、截距、曲线下面积(AUC)、最大斜率或解离常数(Kd)。7.权利要求6所述的方法，其中所述二次曲线参数由线性或对数回归曲线计算。8.权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述二次曲线参数是拟合到在步骤(c)中绘制或计算的每个曲线的逻辑斯蒂曲线的最大渐近线、最小渐近线、Hill斜率(或斜率因子)或拐点。9.权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述抗原是天然存在的蛋白质或多肽、重组蛋白质或多核苷酸、合成的蛋白质或多肽、合成肽、肽模拟物、多糖或核酸。10.权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述抗体是疾病状态或疾病易感性的生物标志物。11.权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述抗体是自身抗体。12.权利要求11所述的方法，其中所述自身抗体对肿瘤标志物蛋白具有特异性。13.权利要求12所述的方法，其中所述肿瘤标志物蛋白选自：EGFR、MUC1、信号转导/细胞周期调节蛋白Myc、c-myc、L-myc2、p53、ras(或Ras)、BRCA1、BRCA2、APC、CA125、PSA、CEA、CA19.9、NY-ESO-1、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、PSCA(前列腺干细胞抗原)、EpCam(上皮细胞粘附分子)、HER2(也称为c-erbB2)、CAGE、CAGE1、CAGE2、细胞角蛋白、恢复蛋白、激肽释放酶、膜联蛋白、甲胎蛋白(AFP)、GRP78、乳腺珠蛋白、raf、β-人绒毛膜促性腺激素b-HCG、4-5抗原、SOX2、GBU4-5、MAGE、HuD、HE4、SALL4、α烯醇化酶、p62、RalA、细胞周期蛋白B1、钙网蛋白R、IMP1、玻连蛋白(例如VTN10)、SSX1、TMP21、NPC1L1C、TMOD1、CAMK1、RGS1、PACSIN1、RCV1、MAPKAPK3、细胞周期蛋白E2、细胞角蛋白8(CK8)、18(CK18)、19(CK19)、20(CK20)、SCC、proGRP、血清淀粉样蛋白A、α-1-抗胰蛋白酶、载脂蛋白CIII、胸腺素β4、HDJ1和HDGF。14.权利要求11所述的方法，其中所述自身抗体是自身免疫病的特征或与其相关。15.权利要求14所述的方法，其中所述自身免疫病是类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、原发性胆汁性肝硬化(PBC)、自身免疫性甲状腺炎、桥本甲状腺炎、自身免疫性胃炎、恶性贫血、自身免疫性肾上腺炎、艾迪生病、自身免疫性甲状旁腺功能减退、自身免疫性糖尿病、重症肌无力、副肿瘤性神经障碍例如兰伯特-伊顿肌无力综合征、炎性肠病、结节病和自身免疫性肝炎。16.权利要求11所述的方法，其中所述自身抗体是导致器官功能不全或衰竭之肾病或肝病的特征或与其相关。17.权利要求1至11中任...

【专利技术属性】
技术研发人员：安德烈亚·默里，杰弗瑞·内尔·哈米尔顿费尔利，贾里德·艾伦，
申请(专利权)人：昂西免疫有限公司，
类型：发明
国别省市：英国,GB