一种基于生物发光法测定斑马鱼M受体水平的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于生物发光法测定斑马鱼M受体水平的方法，步骤包括：取斑马鱼组织上清液将GDP和GMP转化为GTP；将ATP和UTP破坏掉；将GTP转化为ATP；检测ATP并进行数据处理计算得出斑马鱼M受体水平变化。本发明专利技术首次提出基于生物发光法检测斑马鱼M受体的含量变化，无需测定M受体蛋白含量，该方法灵敏度高、稳定性好、不需要复杂设备；本发明专利技术操作简单快捷、特异性高、成本低，从分子方面研究胆碱能系统的内在作用机制，再结合斑马鱼行为变化方面的研究，最终实现对水质的实时在线评估与监测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生理生态学
，具体涉及一种基于生物发光法测定斑马鱼M受体水平的方法。
技术介绍
近年来，随着经济的快速发展，水污染问题日益突出，严重影响生态环境的平衡和稳定。斑马鱼是一种小型热带淡水鱼，近年来，众多研究显示斑马鱼应用于环境毒理学研究中有其独特的优势，斑马鱼已逐渐成为环境毒理学家们的新宠，利用斑马鱼对水环境污染物进行快速监测已成为目前研究的热点。目前，人们通常依据对斑马鱼死亡率、畸形率、体长、体重、躯体质量指数(BMI)等进行测定，然而斑马鱼的生物的病理损伤或死亡往往较为滞后，难以发挥快速监测的作用。近年来，有越来越多的研究指出鱼类对污染物的适应反应从神经内分泌活动变化开始，而M受体(毒蕈碱型受体)作为神经递质乙酰胆碱的受体，其蛋白含量变化必然受到污染物的影响。因此，对斑马鱼M受体蛋白活性的测定可实现对水环境污染物的快速监测。然而，目前对M受体蛋白活性的测定主要集中在大鼠、小鼠、电鳐这些物种上，方法主要是放射结合分析法、WesternBlotting、ELISA等，这些方法普遍存在技术步骤繁琐、耗时长、试剂价格昂贵、对实验人员人体有潜在危害等缺点，而目前尚没有明确的方法能对斑马鱼M受体的蛋白含量进行测定，而且由于M受体蛋白组织和种属之间存在差异性，因此测定M受体蛋白含量的方法并不具有普适性，所以亟需研发一种灵敏、快速、简便的测定斑马鱼M受体水平的方法。
技术实现思路
为解决现有技术中的上述技术问题，本专利技术人通过研究发现由于斑马鱼M受体属于G蛋白偶联受体，参与细胞信号转导过程，其在信号传导时会消耗GTP，当斑马鱼暴露在环境中污染物之后，作为G蛋白偶联受体的M受体蛋白水平会发生相应变化，此时细胞GTP水平同样会发生变化，因此可以通过GTP水平变化来反映M受体水平变化。本专利技术即是将GTP转化为ATP通过生物发光法来检测ATP含量，从而实现对GTP的检测，进而测定出斑马鱼M受体水平变化。具体的，本专利技术涉及以下技术方案：本专利技术提供一种生物发光法在测定斑马鱼M受体水平中的应用。此外，本专利技术还提供一种基于生物发光法测定斑马鱼M受体水平的方法，该方法步骤简单，检测结果准确，能够快速测定斑马鱼M受体水平，包括如下步骤：取斑马鱼组织上清液将GDP和GMP转化为GTP；将ATP和UTP破坏掉；将GTP转化为ATP；检测ATP并进行数据处理计算得出斑马鱼M受体水平变化。具体的，一种基于生物发光法测定斑马鱼M受体水平的方法，步骤包括：(1)将斑马鱼组织破碎，低温离心处理，取上清液，将上清液等量置于A、B、C三个孵育管中；(2)将步骤(1)得到上清液中的GDP和GMP转化为GTP；更具体的，首先向各孵育管加入一定量的上清液，然后再向各管中加入PH7.5的两性离子缓冲液，MgCl2和KCl，之后A管不再添加任何物质，B管再加入一定量的磷酸烯醇丙酮酸盐和丙酮酸激酶，C管再加入一定量ATP和鸟苷酸激酶，各孵育管内反应混合液均用超纯水调至相同体积；将反应混合物孵育再沸水浴终止反应，然后将装有反应混合液的孵育管置于冰块中冷却；(3)破坏各反应混合液中的ATP和UTP，具体的，从步骤(2)的各孵育管中的混合液中取一定量混合液置于新的孵育管中，向混合液中加入一定量的葡萄糖磷酸盐，葡萄糖，NADP+，两性离子缓冲液，MgCl2，己糖激酶，6-磷酸葡萄糖脱氢酶和二磷酸尿苷葡萄糖焦磷酸化酶；各孵育管内反应混合液均用超纯水调至相同体积；将含有反应混合液的各孵育管孵育一定时间后再置于冰块中冷却一定时间；(4)将各反应混合液中的GTP转化为ATP；具体的，从步骤(3)的各孵育管中取出一定量反应混合液置于新的孵育管中，然后向所述各孵育管中加入一定量二磷酸核苷激酶，ADP，两性离子缓冲液，MgSO4，EDTA和二硫苏糖醇，将各孵育管内反应混合液均用超纯水调至相同体积并将含有反应混合液的各孵育管孵育一定时间；(5)检测步骤(4)得到的各混合液中的ATP；具体的，从步骤(4)的各孵育管中取出一定量反应混合液，然后向所述各反应混合液中加入一定量萤火虫荧光素酶，在全自动计数菌落器上测试结果；(6)数据处理；由于细胞内的GTP、GDP、GMP水平是相对恒定的，三个管测试出来的ATP水平分别代表GTP、GDP和GMP水平，所以不同时间斑马鱼细胞内GTP：GDP：GMP水平变化即可得出斑马鱼M受体水平变化。优选的，所述步骤(2)中，各孵育管内反应混合液用超纯水调定体积后，所述两性离子缓冲液的浓度为15mmol/L，所述MgCl2的浓度为1.0mmol/L，所述KCl的浓度为2.5μmol/L，所述磷酸烯醇丙酮酸盐的浓度为0.02mmol/L，所述丙酮酸激酶的浓度为16mg/L，所述ATP浓度为0.4μmol/L，所述鸟苷酸激酶浓度为0.8U/mL；优选的，所述步骤(2)中，所述孵育温度为30℃，时间为30min；所述冷却时间为10min；优选的，所述步骤(3)中，各孵育管内反应混合液用超纯水调定体积后，所述葡萄糖磷酸盐浓度为0.5mmol/L，所述葡萄糖浓度为0.5mmol/L，所述NADP+浓度为0.5mmol/L，所述两性离子缓冲液浓度为75mmol/L，所述MgCl2的浓度为0.5mmol/L，所述KCl的浓度为0.0125mmol/L，所述己糖激酶的浓度为2U/mL，所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶的浓度为0.8U/mL，所述二磷酸尿苷葡萄糖焦磷酸化酶的浓度为1U/mL；优选的，所述步骤(3)中，所述孵育温度为30℃，时间为30min；所述冷却时间为10min；优选的，所述步骤(4)中，各孵育管内反应混合液用超纯水调定体积后，所述二磷酸核苷激酶浓度为0.025U/mL，所述ADP浓度为37.5pmol/mL，所述两性离子缓冲液的浓度为31.25mmol/L，所述MgSO4浓度为6.25mmol/L，所述二硫苏糖醇的浓度为0.625mmol/L；所述步骤(4)中，所述孵育温度为30℃，时间为5min；优选的，所述步骤(5)中，所述萤火虫荧光素酶浓度为20mmol/L。本专利技术还公开了上述方法在水质实时在线评估与监测中的应用。本专利技术的有益效果为：(1)本专利技术基于GTP与斑马鱼M受体之间的关系，首次提出基于生物发光法检测斑马鱼M受体的含量变化，无需直接测定M受体蛋白含量，该方法灵敏度高、稳定性好、不需要复杂设备；(2)本专利技术操作简单快捷、特异性高、成本低，本专利技术从分子方面研究胆碱能系统的内在作用机制，再结合斑马鱼行为变化方面的研究，最终能够实现对水质的实时在线评估与监测。附图说明图1为实验例1中实验组与对照组GTP：GDP：GMP对比曲线图具体实施方式结合附图对本专利技术作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本专利技术，并不对其内容进行限定。实施例1(1)将斑马鱼组织破碎，低温离心处理，取上清液，将上清液等量置于A、B、C三个孵育管中；(2)将步骤(1)得到上清液中的GDP和GMP转化为GTP；更具体的，首先向各孵育管加入50μL的上清液，然后再向各管中加入PH7.5的两性离子缓冲液，MgCl2和KCl，之后A管不再添加任何物质，B管再加入一定量的磷酸烯醇丙酮酸盐和丙酮酸激酶，C管再加入一定量ATP和鸟苷酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生物发光法在测定斑马鱼M受体水平中的应用。

【技术特征摘要】
1.一种生物发光法在测定斑马鱼M受体水平中的应用。2.一种基于生物发光法测定斑马鱼M受体水平的方法，其特征在于，步骤包括：取实验组和对照组斑马鱼组织上清液将GDP和GMP转化为GTP；将ATP和ΜTP破坏掉；将GTP转化为ATP；检测ATP并进行数据处理计算得出实验前后斑马鱼M受体水平变化。3.如权利要求2所述的一种基于生物发光法测定斑马鱼M受体水平的方法，其特征在于，步骤包括：(1)将斑马鱼组织破碎，低温离心处理，取上清液，将上清液等量置于A、B、C三个孵育管中；(2)将步骤(1)得到上清液中的GDP和GMP转化为GTP；更具体的，首先向各孵育管加入一定量的上清液，然后再向各管中加入PH7.5的两性离子缓冲液，MgCl2和KCl，之后A管不再添加任何物质，B管再加入一定量的磷酸烯醇丙酮酸盐和丙酮酸激酶，C管再加入一定量ATP和鸟苷酸激酶，各孵育管内反应混合液均用超纯水调至相同体积；将反应混合物孵育再沸水浴终止反应，然后将装有反应混合液的孵育管置于冰块中冷却；(3)破坏各反应混合液中的ATP和UTP，具体的，从步骤(2)的各孵育管中的混合液中取一定量混合液置于新的孵育管中，向混合液中加入一定量的葡萄糖磷酸盐，葡萄糖，NADP+，两性离子缓冲液，MgCl2，己糖激酶，6-磷酸葡萄糖脱氢酶和二磷酸尿苷葡萄糖焦磷酸化酶；各孵育管内反应混合液均用超纯水调至相同体积；将含有反应混合液的各孵育管孵育一定时间后再置于冰块中冷却一定时间；(4)将各反应混合液中的GTP转化为ATP；具体的，从步骤(3)的各孵育管中取出一定量反应混合液置于新的孵育管中，然后向所述各孵育管中加入一定量二磷酸核苷激酶，ADP，两性离子缓冲液，MgSO4，EDTA和二硫苏糖醇，将各孵育管内反应混合液均用超纯水调至相同体积并将含有反应混合液的各孵育管孵育一定时间；(5)检测步骤(4)得到的各混合液中的ATP；具体的，从步骤(4)的各孵育管中取出一定量反应混合液，然后向所述各反应混合液中加入一定量萤火虫荧光素酶，在全自动计数菌落器上测试结果；(6)数据处理；由于细胞内的GTP、GDP、GMP水平是相对恒定的，三个管测试出来的ATP水平分别代表GTP、GDP和GMP水平，所以不同时间斑马鱼细胞内GTP：GDP：GMP水平变化即可得出斑马鱼M...

【专利技术属性】
技术研发人员：任宗明，任晴，张婷婷，齐鲁慧子，邢娜，李尚戈，
申请(专利权)人：山东师范大学，
类型：发明
国别省市：山东;37