一种电致化学发光免疫传感器的制备、产品、检测及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种基于CdTe@MOFs/CdTeQDs复合物的电致化学发光免疫传感器的制备方法、产品、检测方法及应用，属于电化学发光传感器领域。采用一种金属有机骨架材料来固载量子点，通过利用金属有机骨架材料的特殊结构固定量子点于金属有机骨架材料内部及表面进而用此复合材料来固载第二抗体，并在纳米金功能化的二氧化钛复合物的辅助下固载第一抗体，与金属有机骨架材料/量子点/抗体共耦复合物及抗原形成双抗夹心免疫反应模式，实现了目标物识别及检测过程，极大程度地增强了电致化学发光信号。根据对不同浓度的待测物的电致化学发光信号强度的不同，实现对生化标志物的有效检测。

Preparation, product, detection and application of an electro chemiluminescence immune sensor

The invention discloses a preparation method, a product, a detection method and an application of an electrochemiluminescence immunoassay sensor based on a CdTe@MOFs/CdTeQDs complex. Using a metal organic framework material supported by the special structure of quantum dots, fixed quantum dots using metal organic frameworks in metal organic frameworks and on the surface of the composite material and then supported the second antibody, and assisted in titanium dioxide nano gold functionalized complexes supported under the first antibody, and metal organic frameworks / quantum dots / antibody complexes and the formation of common coupled antigen sandwich immune response pattern, realize the target recognition and detection process, greatly enhanced the ECL signal. According to the different intensity of the chemiluminescence signal of different concentrations, the effective detection of the biochemical markers was achieved.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于电致化学发光分析免疫检测领域，具体涉及一种基于CdTe@MOFs/CdTeQDs复合物的电致化学发光免疫传感器的制备方法、产品、检测方法及应用。
技术介绍
急性心肌梗死是冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死。此病患者可出现心痛、心律失常、心衰等临床症状，病情严重者可发生昏迷或休克，甚至危及其生命。相关的研究表明，在急性心肌梗死患者发病后的6小时内，对其进行有效的治疗，可取得良好的治疗效果。因此对此病患者进行早期的诊断和治疗对挽救其生命具有重要的意义。心肌肌钙蛋白I(cTnI)是心肌肌钙蛋白的一种亚型，正常人血液中含量很低，当心肌细胞损伤时，cTnI在血液中的含量迅速升高，是急性心肌梗塞的特异性诊断指标。因此，检测患者的cTnI水平对于诊断急性心肌梗死具有较高的特异度和敏感度。迄今为止，检测cTnI主要依靠基于各种检测技术的标记免疫夹心法，例如，酶联免疫测定，光磁生物传感器，电化学免疫检测法。但是，由于这些方法有步骤复杂、耗费时间、破坏环境等缺点，所以依旧要求提高检测技术水平。电致化学发光分析技术由于其低背景、高灵敏度、宽线性范围、低耗用等突出优点而倍受关注。目前研究最多的电致化学发光体系包括联吡啶钌及其衍生物、鲁米诺及其衍生物、过硫酸根和量子点体系。与传统分子发光体相比，量子点由于尺寸效应的影响，具有优良的光、电和电化学性质，而量子点的电致化学发光在生化分析是一种非常有用的技术，具有背景小、灵敏度高、线性范围宽等优点。而量子点在电致化学发光传感器的应用中，量子点的固载是基于量子点的固态电致化学发光生物传感器制造中最重要的一步。通常来说，通过将量子点包埋在一些成膜材料中来实现量子点的固载，例如Nafion或壳聚糖。然而，通过包埋法制备的量子点薄膜会受到成膜材料的溶胀性和空间位阻效应的影响，很难获得稳定和强的电致化学发光信号。引入固载基质来制备具有增强的和稳定的电致化学发光信号的量子点纳米复合材料，极有可能解决上述问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种基于CdTe@MOFs/CdTeQDs复合物的电致化学发光免疫传感器的制备方法、产品、检测方法及应用，采用一种金属有机骨架材料来固载量子点，通过利用金属有机骨架材料的特殊结构固定量子点于金属有机骨架材料内部及表面进而用此复合材料来固载第二抗体，并在纳米金功能化的二氧化钛复合物的辅助下固载第一抗体，与金属有机骨架材料/量子点/抗体共耦复合物及抗原形成双抗夹心免疫反应模式，实现了目标物识别及检测过程，极大程度地增强了电致化学发光信号。根据对不同浓度的待测物的电致化学发光信号强度的不同，实现对生化标志物的有效检测。另外，本专利技术具有特异性好，灵敏度高及稳定性好等优点，能够有效地实现生化标志物的高灵敏检测分析。为实现上述专利技术目的，具体提供了如下的技术方案：1、一种基于CdTe@MOFs/CdTeQDs复合物的电致化学发光免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：1)依次用0.3、0.05μm的氧化铝粉末对直径为4mm的玻碳电极进行抛光，先用超纯水清洗干净，再分别在超纯水、乙醇、超纯水中超声洗涤，晾干备用；2)在电极表面滴加5μL，质量分数为20％～25％的Au@TiO2纳米复合物，室温下晾干得修饰电极；3)在修饰电极表面滴加15μL，质量分数为2％～5％的抗体，4℃静置孵育，用超纯水漂洗，得到免疫电极；4)在免疫电极表面滴加质量分数为0.25％牛血清白蛋白封闭非特异性活性位点，在37℃条件下孵育30～40分钟，取出，水洗，于室温下放置晾干于4℃保存；5)将特异性抗原蛋白滴加在电极上用于捕捉抗体，于37℃反应40～60分钟，反应完成后用磷酸盐缓冲溶液冲洗去掉未结合的蛋白样品；6)将CdTe@MOFs/CdTeQDs复合物标记的抗体共耦合物滴在电极上与抗原特异性识别，37℃下反应80～100分钟，用磷酸盐缓冲溶液洗涤3次以除去非特异性吸咐的共耦合物，于4℃保存备用。优选的：所述Au@TiO2纳米复合物的制备方法如下：1)将四甲基氢氧化铵滴加到含有超纯水的两口圆底烧瓶中，将烧瓶在冰浴的条件下使溶液温度降至2℃，然后在剧烈搅拌的条件下将异丙醇钛的异丙醇溶液逐滴加至烧瓶中，滴加完后继续搅拌10～20分钟，撤去冰浴转为加热装置，在温度为90～100℃加热回流12～15小时；2)将经步骤1)反应后的溶液转入反应釜中，在175℃条件下，反应4小时，自然冷却后离心得白色固体，用超纯水洗涤后分散于超纯水中于4℃下保存备用；3)将1wt％的HAuCl4·4H2O稀释到步骤2)所述的超纯水中，在剧烈的搅拌下，加入1wt％柠檬酸钠，煮沸10～15分钟后继续搅拌15～20分钟，将溶液冷却并在4℃下储存得带负电荷的AuNPs；4)将PDDA滴加到TiO2溶液并在4℃下搅拌过夜，离心洗涤除去多余的PDDA，得到PDDA功能化的TiO2溶液；5)将步骤3)得到的带负电荷的AuNPs滴加到步骤4)得到的PDDA功能化的TiO2溶液中并搅拌制备Au@TiO2纳米复合物，将制得的Au@TiO2纳米复合物离心，用超纯水洗涤2次除去过量的试剂得Au@TiO2纳米复合物，重悬于超纯水中。优选的：所述CdTe@MOFs/CdTeQDs复合物标记的抗体共耦合物的制备方法如下：I、CdTeQDs的制备：将CdCl2·2.5H2O溶于超纯水，接着将柠檬酸钠，亚碲酸钠，3-巯基丙酸和硼氢化钠依次加入上述溶液中搅拌3～5分钟混合均匀，将所得的混合溶液转移到圆底烧瓶中，并在120～130℃下加热回流8～10小时，自然冷却，得到的CdTeQDs用乙醇离心洗涤后分散于乙醇溶液或超纯水中于4℃下保存备用；II、CdTe@MOFs的制备：将聚乙烯吡咯烷酮充分搅拌溶解于N,N-二甲基甲酰胺和乙醇混合溶液中，所述混合溶液中N,N-二甲基甲酰胺甲基甲酰胺和乙醇的质量为18:11，聚乙烯吡咯烷酮与混合溶液的质量体积比为100:15，将CdTeQDs乙醇溶液在搅拌条件下逐滴加入在上述混合溶液中，所述CdTeQDs与混合溶液质量体积比范围3.3％～4％，将六水合硝酸锌和2-氨基-对苯二甲酸的二甲基甲酰胺溶液与上述溶液混合后，将所得混合溶液超声处理20～30分钟，然后将其转移至内衬聚四氟乙烯的不锈钢高压反应釜中密封，置于烘箱中在90～100℃温度下反应20小时，自然冷却至室温，离心，依次用二甲基甲酰胺和乙醇洗涤，得到产物CdTe@MOFs；III、CdTe@MOFs/CdTeQDs复合物与抗体共耦合物的制备：取制备好的CdTeQDs水溶液中加入新配置的EDC和NHS混合溶液，在4℃下搅拌并加入上述制备好的CdTe@MOFs，所述CdTeQDs与CdTe@MOFs的质量比为5:1，并在4℃下继续搅拌8～10小时，反应完成后，便制得CdTe@MOFs/CdTeQDs复合物，继续加入新配置的EDC和NHS混合溶液搅拌，将抗体蛋白加入上述CdTe@MOFs/CdTeQDs复合物混合溶液中在4℃下搅拌反应过夜，接着离心，用超纯水洗涤后，重悬于超纯水中，继续加入BSA在4℃下搅拌反应1～2小时，便制得了CdTe@MOFs/CdTeQDs复合物与抗体共耦合物，所得产物保存于4℃下。进一步，步骤5)及本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于CdTe@MOFs/CdTeQDs复合物的电致化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)依次用0.3、0.05μm的氧化铝粉末对直径为4mm的玻碳电极进行抛光，先用超纯水清洗干净，再分别在超纯水、乙醇、超纯水中超声洗涤，晾干备用；2)在电极表面滴加5μL，质量分数为20％～25％的Au@TiO2纳米复合物，室温下晾干得修饰电极；3)在修饰电极表面滴加15μL，质量分数为2％～5％的抗体，4℃静置孵育，用超纯水漂洗，得到免疫电极；4)在免疫电极表面滴加质量分数为0.25％牛血清白蛋白封闭非特异性活性位点，在37℃条件下孵育30～40分钟，取出，水洗，于室温下放置晾干于4℃保存；5)将特异性抗原蛋白滴加在电极上用于捕捉抗体，于37℃反应40～60分钟，反应完成后用磷酸盐缓冲溶液冲洗去掉未结合的蛋白样品；6)将CdTe@MOFs/CdTeQDs复合物标记的抗体共耦合物滴在电极上与抗原特异性识别，37℃下反应80～100分钟，用磷酸盐缓冲溶液洗涤3次以除去非特异性吸咐的共耦合物，于4℃保存备用。

【技术特征摘要】
1.一种基于CdTe@MOFs/CdTeQDs复合物的电致化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)依次用0.3、0.05μm的氧化铝粉末对直径为4mm的玻碳电极进行抛光，先用超纯水清洗干净，再分别在超纯水、乙醇、超纯水中超声洗涤，晾干备用；2)在电极表面滴加5μL，质量分数为20％～25％的Au@TiO2纳米复合物，室温下晾干得修饰电极；3)在修饰电极表面滴加15μL，质量分数为2％～5％的抗体，4℃静置孵育，用超纯水漂洗，得到免疫电极；4)在免疫电极表面滴加质量分数为0.25％牛血清白蛋白封闭非特异性活性位点，在37℃条件下孵育30～40分钟，取出，水洗，于室温下放置晾干于4℃保存；5)将特异性抗原蛋白滴加在电极上用于捕捉抗体，于37℃反应40～60分钟，反应完成后用磷酸盐缓冲溶液冲洗去掉未结合的蛋白样品；6)将CdTe@MOFs/CdTeQDs复合物标记的抗体共耦合物滴在电极上与抗原特异性识别，37℃下反应80～100分钟，用磷酸盐缓冲溶液洗涤3次以除去非特异性吸咐的共耦合物，于4℃保存备用。2.根据权利要求1所述一种基于CdTe@MOFs/CdTeQDs复合物的电致化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于：所述Au@TiO2纳米复合物的制备方法如下：1)将四甲基氢氧化铵滴加到含有超纯水的两口圆底烧瓶中，将烧瓶在冰浴的条件下使溶液温度降至2℃，然后在剧烈搅拌的条件下将异丙醇钛的异丙醇溶液逐滴加至烧瓶中，滴加完后继续搅拌10～20分钟，撤去冰浴转为加热装置，在温度为90～100℃加热回流12～15小时；2)将经步骤1)反应后的溶液转入反应釜中，在175℃条件下，反应4小时，自然冷却后离心得白色固体，用超纯水洗涤后分散于超纯水中于4℃下保存备用；3)将1wt％的HAuCl4·4H2O稀释到步骤2)所述的超纯水中，在剧烈的搅拌下，加入1wt％柠檬酸钠，煮沸10～15分钟后继续搅拌15～20分钟，将溶液冷却并在4℃下储存得带负电荷的AuNPs；4)将PDDA滴加到TiO2溶液并在4℃下搅拌过夜，离心洗涤除去多余的PDDA，得到PDDA功能化的TiO2溶液；5)将步骤3)得到的带负电荷的AuNPs滴加到步骤4)得到的PDDA功能化的TiO2溶液中并搅拌制备Au@TiO2纳米复合物，将制得的Au@TiO2纳米复合物离心，用超纯水洗涤2次除去过量的试剂得Au@TiO2纳米复合物，重悬于超纯水中。3.根据权利要求1所述一种基于CdTe@MOFs/CdTeQDs复合物的电致化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于：所述CdTe@MOFs/CdTeQDs复合物标记的抗体共耦合物的制备方法如下：I、CdTeQDs的制备：将CdCl2·2.5H2O溶于超纯水，接着将柠檬酸钠，亚碲酸钠，3-巯基丙酸和硼氢化钠依次加入上述溶液中搅拌3～5分钟混合均匀，将所得的混...

【专利技术属性】
技术研发人员：卓颖，梁文斌，余燕清，柴雅琴，袁若，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆;50