一种自发永生化的绵羊外周血来源细胞系及其建立方法技术

本发明专利技术涉及生物细胞系，具体公开了一种自发永生化的绵羊外周血来源细胞系及其建立方法。具体为，采集成年健康绵羊的外周血，利用人外周血淋巴细胞分离液分离细胞后，进行细胞的培养与传代，传代过程中，通过对消化步骤的优化以及对培养基的优化，获得一种均一性高的自发永生化的绵羊外周血来源细胞系，该细胞系可表达绵羊的多种先天免疫受体，可用于细胞生物学、病原与宿主相互作用的体外研究。为促进绵羊健康养殖及疫病防控提供了很好的细胞学工具，为体外研究病原与绵羊的相互作用、评估药物或生物制品对绵羊的影响，更好的服务绵羊的健康养殖。

Spontaneous immortalization sheep peripheral blood source cell line and method for establishing the same

The invention relates to a biological cell line, in particular to a spontaneous immortalization sheep peripheral blood source cell line and a method for establishing the same. Specifically, the collection of peripheral blood of healthy adult sheep, were isolated cells using human peripheral blood lymphocytes, were cultured and passaged cells, passage, through the optimization of the digestion step and the optimization of culture medium, to obtain a high uniformity in the spontaneous immortalization of sheep from peripheral blood cell line, the cell line can express a variety of innate immune receptors of sheep, can be used for in vitro study of pathogen and host cell biology, interaction. Provides a good tool for promoting the cytology of sheep healthy breeding and disease prevention and control, for in vitro interactions, pathogen and sheep to assess the impact of a drug or biological product of sheep, sheep breeding service of better health.

【技术实现步骤摘要】
一种自发永生化的绵羊外周血来源细胞系及其建立方法
本专利技术涉及生物细胞系，具体地说，涉及一种绵羊外周血来源细胞系。
技术介绍
绵羊是全球重要的肉制品和皮毛制品来源动物，在畜牧生产、餐饮、公众健康等领域有重要作用。当前，绵羊的多种重大疫病、如口蹄疫、小反刍兽疫、布鲁氏杆菌病、捻转血矛线虫病等越来越受到重视，其中布鲁氏杆菌病不仅严重危害绵羊本身，也极大地威胁人类的健康安全。然而，当前的研究中，研究这些疫病的科学工具和技术严重缺乏，制约了相关领域的技术发展。绵羊来源的细胞系是研究病原体与绵羊相互作用、绵羊免疫应答等的可靠细胞学工具。然而，目前已知的可用于研究的绵羊细胞系(如卵巢细胞系、成纤维细胞系)较少，严重制约了这种研究的开展。因此，获得更多的具有不同特性的绵羊细胞系将促进绵羊重大疫病防控的研究。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种自发永生化的绵羊外周血来源细胞系及其建立方法。为了实现本专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：第一方面，本专利技术提供了一种自发永生化的绵羊外周血来源细胞系的建立方法，包括如下步骤：(1)细胞分离：利用真空采血管(含有肝素锂)从成年健康绵羊颈静脉采血5mL，在细胞超净台进行后续的细胞分离及培养工作。取新鲜抗凝全血5mL，用等体积PBS稀释全血后，先在离心管中加入5mL的常温淋巴细胞分离液(达人外周血淋巴细胞分离液)，然后将稀释后的血缓缓加到分离液液面上方。在室温下，选择水平转子700～800g(2000～2500rpm)离心20～30min。离心结束后，用移液器小心吸取血浆层与分离液层之间是一层薄且较致密的白膜，即：单个核细胞(包括淋巴细胞和单核细胞)层到另一离心管中。将细胞用PBS稀释重悬后再室温下用水平转子250g(1000rpm)，离心10min并重复洗涤1次。此步骤中使用的人外周血淋巴细胞分离液效果优于小鼠淋巴细胞分离液及Percoll等分离试剂，外周血淋巴细胞的得率明显高。(2)细胞培养：将细胞沉淀用培养基(RPMI1640高糖培养基(GIBICO)，添加10％FBS(GIBICO)，5％绵羊血清(Invitrogen)，链霉素及青霉素含200IU/mL，环丙沙星10μg/mL)，重悬后计数，按照106密度铺至10cm直径的细胞培养皿，置于含5％CO2的37℃细胞培养箱中培养。此步骤中添加绵羊血清是为绵羊外周血淋巴细胞生长提供更接近于天然状态的生长微环境；链霉素及青霉素是为了抑制可能的细菌污染，环丙沙星是为抑制可能的支原体污染。(3)细胞的消化与传代：细胞在2h后用PBS洗涤去除未贴壁细胞，重新加入新鲜的上述培养基培养。48h后，细胞培养用PBS洗涤去除培养基后，加入含EDTA的0.25％胰酶消化液0.5mL，于含5％CO2的37℃细胞培养箱中孵育5min，然后用吸管吹打使细胞脱落，重悬为单个细胞，加入培养基终止消化后，将细胞转移至新的培养皿中继续培养。在显微镜下观察细胞生长至50％铺满状态时进行细胞传代。在培养的第3代，将细胞培养基中的RPMI1640高糖培养基减少50％，同时添加等体积的DMEM高糖培养基，再次培养和传代3次。该步骤中须使用含EDTA的0.25％胰酶，在后期传代培养时对比发现，不含EDTA的0.25％胰酶不能对细胞进行消化(加入0.25％胰酶消化液0.5mL，于含5％CO2的37℃细胞培养箱中孵育10min，显微镜下观察细胞仍然处于50％状态，细胞形态也未发生改变，用吸管吹打也未有大量细胞悬浮)。在细胞处于50％铺满状态进行传代是为了使分裂能力强的细胞能更好的被传至下一代次。(4)细胞亚克隆：在连续培养的第4代，从培养皿中发现密集生长的单个细胞克隆总计8个，每个细胞克隆大直径为4-5mm(见图1左)，肉眼明显可见。用记号笔在培养皿底部标记肉眼可见的细胞克隆后，用细胞克隆环(直径5mm)将细胞克隆罩住，在环内加入含EDTA的0.25％胰酶消化液10μL，于含5％CO2的37℃细胞培养箱中孵育5min，用移液器吸头吹打细胞，将获得的细胞悬液转移至6孔细胞板进行继续培养。该步骤使用了细胞克隆环，可以确保获得的细胞来源为单一克隆，为建立细胞系奠定了基础。(5)细胞的继续传代培养：在6孔细胞板继续培养的细胞按照上述细胞传代的要求，在处于100％铺满状态进行传代。在第6代后，将培养液中的RPMI1640高糖培养基全部更换为DMEM高糖培养基。待细胞生长铺满至呈现成纤维状细胞形态(见图1右上)时进行下一代的传代。每隔20代对传代细胞做一次冻存备份，细胞继续传代至50代。该步骤中更换培养基是为以后进行连续传代提供稳定的培养基，根据对比实验，含有RPMI1640高糖培养基的培养液效果差于DMEM高糖培养基的培养液。另外，在继续传代过程中待细胞生长至铺满且呈现成纤维状细胞形态后再传代，可以确保细胞的均一性。第二方面，本专利技术提供了经前述方法建立的自发永生化的绵羊外周血来源细胞系。该细胞系可表达MHC-I类分子及先天免疫相关的TLR分子，并可连续传代培养超过50代。所述细胞系适用于体外进行绵羊的细胞生物学、免疫学研究。可用于病原体如病毒、细菌和寄生虫与宿主相互作用的研究。例如，可用于刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)的体外培养，可用于捻转血矛线虫(Haemonchuscontortus)等寄生虫的体外培养研究。本专利技术涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供了一种绵羊来源的细胞系，该细胞系可表达绵羊的多种先天免疫受体，可用于细胞生物学、病原与宿主相互作用的体外研究。该细胞系为促进绵羊健康养殖及疫病防控提供了很好的细胞学工具，为体外研究病原与绵羊的相互作用、评估药物或生物制品对绵羊的影响，更好的服务绵羊的健康养殖。可显著改善目前绵羊先天免疫应答等研究所缺乏的细胞学工具，解决了目前绵羊生产中重大动物疫病防控的难题。附图说明图1为本专利技术所获得的自发性永生化的绵羊外周血来源细胞系。在将外周血单个核细胞(PBMC)连续在体外培养后，大部分细胞衰老死亡，剩余的自发永生化细胞形成细胞克隆。将此细胞克隆转移至细胞板上培养，可见其在铺满细胞板后呈现成纤维状细胞的特征。而单个生长细胞或未铺满的细胞则呈现多形性。图2为本专利技术获得的自发性永生化的绵羊外周血来源细胞系进行MHC-I免疫荧光染色，图中可见细胞膜有大量MHC-I分子，而细胞核着染DAPI后呈现亮蓝色。图3为本专利技术获得的自发性永生化的绵羊外周血来源细胞系进行实时定量PCR测定TOLL样受体分子TLR1-TLR10表达情况。使用来自细胞系提取的总RNA作为材料进行反转录获取cDNA样品，扩增结果可见部分TLR分子在正常生长(C)时不表达，而在加LPS(L)刺激后则发生明显的表达，“+”和“-”分别为阳性和阴性模板对照。图4为本专利技术获得的自发性永生化的绵羊外周血来源细胞系进行刚第弓形虫的体外培养实验。所使用的刚第弓形虫为表达黄色荧光蛋白(YFP)基因的转基因RH虫株。弓形虫速殖子在细胞内形成了假包囊，其中含有数十个甚至数百个速殖子。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种自发永生化的绵羊外周血来源细胞系的建立方法，其特征在于，采集成年健康绵羊的外周血，利用人外周血淋巴细胞分离液分离细胞后，进行细胞的培养与传代。

【技术特征摘要】
1.一种自发永生化的绵羊外周血来源细胞系的建立方法，其特征在于，采集成年健康绵羊的外周血，利用人外周血淋巴细胞分离液分离细胞后，进行细胞的培养与传代。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)细胞分离；(2)细胞培养：使用添加10％FBS，5％绵羊血清，200IU/mL链霉素和青霉素与10μg/mL环丙沙星的RPMI1640高糖培养基进行细胞培养；(3)细胞消化与传代：用PBS洗涤去除培养基后，加入含EDTA的0.25％胰酶消化液进行消化，重悬得到单个细胞，加入RPMI1640高糖培养基中继续培养；当细胞生长至50％铺满状态时进行细胞传代；传代3次后，将RPMI1640高糖培养基减少50％，同时添加等体积的DMEM高糖培养基，再培养传代3次；(4)细胞亚克隆：待培养得到肉眼可见的细胞克隆后，对单一细胞克隆进行重悬后，继续传代培养；(5)细胞的继续传代培养。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(5)继续传代培养过程中，待细胞生长至铺满且呈现成纤维状细胞形态后再传代，在第6代后，仅使用添加10％FBS，5％绵羊血清，200IU/mL链霉素和青霉素与10μg/mL环丙沙星的DMEM高糖培养基进行传代培养。4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)细胞分离：从成年健康绵羊颈静脉采血，用等体积PBS稀释全血后，先在离心管中加入常温人外周血淋巴细胞分离液，然后将稀释后的血缓缓加到分离液液面上方，在室温下，选择水平转子700～...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘贤勇，索勋，刘群，王思，杜孟泽，索静霞，张思新，顾小龙，汤新明，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11