在CHO细胞中rhIL‑12表达系统的构建方法技术方案

本发明专利技术提供了一种改造后的重组人白细胞介素‑12（rhIL‑12）基因，同时发现了一种在CHO细胞中rhIL‑12表达系统的构建方法。该方法利用基因工程手段，人工合成表达重组人白细胞介素‑12的重组基因，将该重组基因序列插入载体，转化宿主细胞，并得到一种高效表达rhIL‑12真核细胞株。

In CHO cells rhIL 12 expression system construction method

The invention provides a modified recombinant human interleukin 12 (rhIL 12) gene, also found a rhIL in CHO cells 12 expression system construction method. The method of using genetic engineering method, the synthetic expression of recombinant human interleukin 12 recombinant gene, the recombinant gene sequence inserted into the vector, host cell transformation, and obtain a high expression of rhIL eukaryotic cell line 12.

【技术实现步骤摘要】

：本专利技术涉及一种重组蛋白的制备领域，具体公开了一种在CHO细胞中rhIL-12表达系统的构建方法。
技术介绍
：白细胞介素(interleukin，IL)是由多种细胞产生并作用于多种细胞的一类细胞因子，它和血细胞生长因子同属细胞因子。两者相互协调，相互作用，共同完成造血和免疫调节功能。白细胞介素在传递信息，激活与调节免疫细胞，介导T、B细胞活化、增殖与分化及在炎症反应中起重要作用。白细胞介素-12(以下简称IL-12)，由抗原提呈细胞和B细胞产生，是一种异源二聚体形式的前炎症细胞因子，并以这种形式分泌到细胞外。IL-12能诱导IFN-γ产生，在体内免疫应答中(特别是在细菌或寄生虫感染中)它也是IFN-γ产生所必需。IL-12是一由p35和p40(IL-12β)两条链组成的异源二聚体，两个亚单位通过二硫键连接在一起，这种结构在已发现的IL中所罕见。通常情况下，p40的量远超出p70，在鼠中已观察到p40同源二聚体的产生，是由转染的细胞分泌的，p40同源二聚体没有生物学活性，但它能和IL-12Rβ结合，与p70竞争性争夺IL-12受体(IL-12R)而拮抗其生物学作用。单独的p35不具有生物学活性，但却是合成p70的限速因子。根据p35，p40两个亚基表达效率不同，前人研究CN200610123433.1曾将p35，p40基因插入不同效率表达载体来解决这个技术问题。然而其操作复杂，转化率低，表达不稳定，影响了其在工业上的应用。因此目前亟需获得一种操作简单，转化率高，表达稳定的载体来制备rhIL-12。有鉴于此，提出本专利技术。
技术实现思路
：本专利技术是利用同源性不低于95％的人白细胞介素12的p35亚基和p40亚基的人工设计核苷酸编码序列，利用基因工程的方法，人工合成表达人源重组白细胞介素IL-12的重组基因，将该重组基因序列插入载体，转化宿主细胞，表达得到p35和p40两条链组成的异源二聚体，两个亚单位通过二硫键连接在一起，该异源二聚体有生物学活性；并得到一种高效表达人IL-12真核细胞株。专利技术的技术方案为：本专利技术提供了一种改造过的重组人白细胞介素-12基因，其特征在于：经过优化的p35亚基的编码序列如SEQIDNO.1所示；经过优化的p40亚基的编码序列如SEQIDNO.2所示。该基因表达的rhIL-12蛋白不仅生物活性高于野生型，其在pcDNA3.1(+)质粒和CHO细胞中表达量也要更大。本专利技术还提供一种重组人白细胞介素-12的真核表达载体，其特征在于：将如权利要求1所述的两段基因装载到该表达载体上。该载体可以为pcDNA3.1(+)质粒(pcDNA3.1(+)质粒标准图谱见图1所示)，也可以为pcDNA3.1(+)质粒(pcDNA3.1(+)质粒标准图谱见图2所示)。将目的基因装载到表达载体的方法为本领域常规技术。例如，如要将SEQIDNO.1，SEQIDNO.2连接到pcDNA3.1(+)质粒上，用限制性内切酶KpnI和NotI对合成的SEQIDNO.1基因及pcDNA3.1(+)质粒进行双酶切，用连接酶将二者连接。用限制性内切酶KpnI和XhoI对合成的SEQIDNO.2基因及pcDNA3.1(+)质粒进行双酶切，用连接酶将二者连接。优选的，SEQIDNO.1和SEQIDNO.2基因序列分别由各自的带有SV40增强子元件的CMV启动子控制。一种可行的方式是，在合成目的基因时，将带有SV40增强子元件的CMV启动子这一段基因与目的基因合成在一条链上。如合成SV40增强子-CMV启动子-SEQIDNO.1或SV40增强子-CMV启动子-SEQIDNO.2这样一段基因。优选的，p35亚基的编码序列与启动子之间有一段可以增加表达效率的内含子片段。此段内含子可以是表达载体携带的(如pCI-neo载体中携带的intron元件)，也可以是外源的内含子，内含子通过酶切，连接布置在p35亚基的编码序列与启动子之间，引用外源内含子的技术手段采用本领域常规技术。在构建好的表达载体中，p35表达单元的结构为：SV40增强子-CMV启动子-可以增加表达效率的内含子片段-SEQIDNO.1，p40表达单元的结构为：SV40增强子-CMV启动子-SEQIDNO.2。优选的，可以增加表达效率的内含子片段为玉米adh1基因内含子片段adh1intron。优选的，将如上所述的任一种表达载体，转化入CHO细胞系制备获得，或者所述细胞用权利要求1所述的核酸序列转染。本专利技术的技术效果：1.本专利技术所提供的改造过的rhIL-12基因，其表达的蛋白，生物活性比野生型更高。2.本专利技术提供的构建rhIL-12表达载体的方法，操作简便，转化率高。3.本专利技术提供的表达rhIL-12真核细胞株，表达量也更高。附图说明：图1为pcDNA3.1(+)质粒标准图谱。图2为pCI-neo质粒标准图谱。具体实施方式：实验例1将SEQIDNO.1，SEQIDNO.2基因片段插入pcDNA3.1(+)载体中，p35表达单元的结构为：SV40增强子-CMV启动子-SEQIDNO.1，p40表达单元的结构为：SV40增强子-CMV启动子-SEQIDNO.2。构建成功表达rhIL-12的CHO细胞株应用Gibco的CHO-S-SFMII进行静止培养，再应用SartoriusBiosSTATplus细胞培养罐进行批培养和连续培养，采用ELISA法检测rhIL-12的含量，静止培养平均浓度为3.6μg/ml，细胞培养罐连续培养平均浓度为8.9μg/ml。将发酵后的培养液纯化后，将产物采用PBMCIFNγ诱生法测定生物活性。具体为，取健康人新鲜外周血，分离淋巴细胞。用含10％灭活胎牛血清的RPMI1640基础培养液配制细胞悬液(台盼蓝检测细胞活力＞95％)，在96孔培养板中，每孔加入100μl细胞悬液及相应稀释浓度的rhIL-12国际标准品和纯化的rhIL-12，空白对照组加RPMI1640基础培养液，阳性对照加Anti-humanCD3(终浓度0.2μg/ml)，37℃，5％CO2条件下培养48h后，收集细胞培养上清液，每孔50μl，离心处理后，ELISA法测定IFNγ含量：在酶标仪450nm处测定各孔吸光度A值，Ascentsoftwareversion2.6软件曲线定量计算IFNγ含量。根据IFNγ含量来计算rhIL-12的生物活性。测得生物活性为9.7×106IU/mg。实验例2筛选适宜的具有表达增强作用的内含子。构建如实验例1所述的表达载体。根据表1所示的引物获得这三段内含子，将此三段内含子插入到p35表达单元中，形成SV40增强子-CMV启动子-内含子-SEQIDNO.1结构。构建成功表达rhIL-12的CHO细胞株应用Gibco的CHO-S-SFMII进行静止培养，再应用SartoriusBiosSTATplus细胞培养罐进行批培养和连续培养，采用ELISA法分别检测不同表达载体的rhIL-12含量。检测结果如表2所示，可知，插入adh1内含子序列后，rhIL-12的表达量提高最多。表1内含子及克隆内含子所需的引物表2插入不同内含子后rhIL-12的表达量对比例1将p40cDNA和p35cDNA片段分别插入两个效率不同的表达载体中，p40cDNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种改造过的重组人白细胞介素‑12基因，其特征在于：经过优化的p35亚基的编码序列如 SEQ ID NO.1所示；经过优化的p40亚基的编码序列如 SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
2015.10.15 CN 20151066242681.一种改造过的重组人白细胞介素-12基因，其特征在于：经过优化的p35亚基的编码序列如SEQIDNO.1所示；经过优化的p40亚基的编码序列如SEQIDNO.2所示。2.一种重组人白细胞介素-12的真核表达载体，其特征在于：将如权利要求1所述的两段基因装载到该表达载体上。3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于：SEQIDNO.1和SEQIDNO.2基因序列分别由各自的带有SV40增强子元件的CMV启动子控制。4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于：p35亚基的编...

【专利技术属性】
技术研发人员：倪彦艳，刘杰森，刘璐瑜，陈松彬，李宇腾，
申请(专利权)人：广东科玮生物技术股份有限公司，广东思峰生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：广东;44