使用重叠引物和熔解探针检测单核苷酸多态性制造技术

本申请描述了在生物或非生物样品中的靶核酸中检测存在或不存在单核苷酸多态性(SNP)的方法。该方法可包括使用引物进行扩增的步骤，利用熔解探针杂交的步骤，和检测步骤，其中熔解探针的预定熔解温度的降低偏移指示SNP存在于样品中，而其中不存在熔解探针的预定熔解温度的降低偏移指示样品中不存在SNP。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】使用重叠引物和膝解探针检测单核昔酸多态性 专利
本专利技术设及基于聚合酶链反应(PCR)的诊断学领域，且更特别地，设及扩增和检测 具有单核巧酸多态性(SNP)的祀核酸的序列变异的方法。 专利技术背景 通过使用巧光标记的烙解探针的PCR检测SNPs先前已有描述（见例如，Huang等人， 2011，PLoS 0肥 6(4) el9206和Luo等人，2011，J. Clin. Microbiol., 49(9)3132-3138)。传统的烙解通过在不存在SNP和存在SNP的情况下，分析具有祀的巧光标记探针的 后-PCR烙解溫度而进行。精屯、设计的烙解探针产生烙解溫度(Tm),其在不存在SNP的情况下 最高，且探针结合区域中发生的任何碱基对改变引起烙解溫度的偏移（降低）。烙解溫度的 偏移可被用来区分野生型(WT)和突变(MT)祀。 不幸的是，一些目的SNPs位于非-保守的基因区域，在那里附近的序列异质性导致 探针烙解溫度的不想要的偏移。运使得难W将具有沉默突变的WT序列与相关的目的SNPs区 分开。与微生物药物抗性有关的SNPs是运样的一些实例，其中赋予药物抗性的特异性SNPs 位于含有附近的WT沉默突变的基因区域。在运样的情况下，在目的SNP附近的探针结合区域 中的任何沉默突变也可产生探针烙解溫度的偏移并产生假阳性结果。因此，需要更精确和 有效的方式W在祀核酸中仅检测目的SNP。本专利技术的实施方案可解决现存序列异质性问题 并使得精屯、设计的烙解探针能够仅检测目的SNP，而不干扰附近的沉默突变。 专利技术概述 本专利技术的实施方案设及用于在生物学或非-生物学样品中快速检测祀核酸中存在或不 存在SNP的方法和试剂盒，例如，通过在单个检验管中的实时聚合酶链反应检测一个或多个 SNPs O 在一个实施方案中，提供在样品中检测祀核酸中的SNP的方法。用于检测SNP的方 法包括W下步骤:进行扩增步骤，其包括使样品与具有第一野生型核酸序列的寡核巧酸引 物接触，其当任何祀核酸存在于样品中时产生扩增产物;进行杂交步骤，其包括使扩增产物 与具有预定烙解溫度的第二野生型核酸序列的寡核巧酸烙解探针接触，其中寡核巧酸烙解 探针的第二野生型核酸序列与寡核巧酸引物的第一野生型核酸序列重叠并在所述SNP所位 于的祀核酸区域上，在一端延伸出来一个或多个核巧酸;和检测扩增产物中存在或不存在 SNP，其中所述寡核巧酸烙解探针的预定烙解溫度的降低偏移指示SNP存在于样品中，而其 中不存在所述寡核巧酸烙解探针的预定烙解溫度的降低偏移指示样品中不存在SNP。 在另一个实施方案中，提供用于在样品中检测祀核酸中的SNP的备选方法。检测 SNP的备选方法包括W下步骤:进行扩增步骤，其包括使样品与具有野生型核酸序列的寡核 巧酸引物接触，当任何祀核酸存在于样品中时产生扩增产物;进行杂交步骤，其包括使扩增 产物与具有预定烙解溫度的SNP特异性核酸序列的寡核巧酸烙解探针接触，其中寡核巧酸 烙解探针的SNP特异性核酸序列与寡核巧酸引物的野生型核酸序列重叠，并在所述SNP所位 于的祀核酸区域上，在一端延伸出来一个或多个核巧酸;和检测扩增产物中存在或不存在 所述SNP，其中所述寡核巧酸烙解探针的预定烙解溫度的降低偏移指示样品中不存在SNP， 而其中不存在所述寡核巧酸烙解探针的预定烙解溫度的降低偏移指示样品中存在SNP。在又一个实施方案中，提供用于在样品中检测祀核酸中的SNP的寡核巧酸引物和 探针集。引物和探针集可包括在可提供检测SNP的试剂盒中。试剂盒可包括具有第一野生型 核酸序列的寡核巧酸引物，其当任何祀核酸存在于样品中时产生扩增产物;和具有预定烙 解溫度的第二野生型核酸序列的寡核巧酸烙解探针，其中寡核巧酸烙解探针的第二野生型 核酸序列与寡核巧酸引物的第一野生型核酸序列重叠，并在所述SNP所位于的祀核酸区域 上，在一端延伸出来一个或多个核巧酸;其中凭借所述寡核巧酸烙解探针的预定烙解溫度 的降低偏移指示SNP存在于样品中和凭借不存在所述寡核巧酸烙解探针的预定烙解溫度的 降低偏移指示样品中不存在SNP，检测扩增产物中存在或不存在所述SNP。在另一个实施方 案中，提供用于在样品中检测祀核酸中的SNP的备选的寡核巧酸引物和探针集。备选的寡核 巧酸引物和探针集可包括在可提供检测SNP的试剂盒中。试剂盒可包括具有野生型核酸序 列的寡核巧酸引物，其当任何祀核酸存在于样品中时产生扩增产物;和具有预定烙解溫度 的SNP特异性核酸序列的寡核巧酸烙解探针，其中寡核巧酸烙解探针的SNP特异性核酸序列 与寡核巧酸引物的第一野生型核酸序列重叠并在所述SNP所位于的祀核酸区域上，在一端 延伸出来一个或多个核巧酸;其中凭借所述寡核巧酸烙解探针的预定烙解溫度的降低偏移 指示样品中不存在SNP和其中不存在所述寡核巧酸烙解探针的预定烙解溫度的降低偏移指 示SNP存在于样品中，检测扩增产物中存在或不存在所述SNP。试剂盒也可包括S憐酸核巧、 核酸聚合酶，和核酸聚合酶的功能所必需的缓冲剂。试剂盒也可包括使用引物、探针，和发 巧光部分来检测样品中存在或不存在SNP的包装插页和用法说明书。[000引在一些实施方案中，方法和试剂盒可包括已用供体和相应的受体(acceptor)巧光 部分标记的探针，或可包括用于标记探针的发巧光(f Iuorophoric)部分。在某些运样的实 施方案中，寡核巧酸（引物和/或探针)具有40个或更少的核巧酸(例如，30个或更少的核巧 酸，25个或更少的核巧酸，20个或更少的核巧酸等）。在某些实施方案中，寡核巧酸的长度介 于8和40个核巧酸之间（如8和30之间，8和25之间，8和20之间）。在某些实施方案中，寡核巧 酸的长度介于12和40个核巧酸之间（如12和30之间，12和25之间，12和20之间）。在一些实施 方案中，寡核巧酸包含至少一个修饰的核巧酸，例如，改变核酸杂交稳定性(与未修饰的核 巧酸相比）。在一些实施方案中，寡核巧酸包含至少一个保守修饰的变异。在一些实施方案 中，寡核巧酸烙解探针可包括允许二级结构形成的核酸序列。寡核巧酸烙解探针可用在5' 末端的巧光部分，和在3'末端的对应的用W巧灭未结合的烙解探针的巧光的受体部分标 记。寡核巧酸烙解探针的核酸序列可提供能使巧光巧灭的随机卷曲构象，除非寡核巧酸探 针与它的祀杂交。运样的二级结构形成通常导致第一(例如，巧光团）和第二(例如，巧灭剂） 巧光部分之间的空间邻近。例如，非-杂交的寡核巧酸烙解探针可被巧灭或仅为微弱巧光 的，但寡核巧酸烙解探针在与其祀杂交时可变为更强巧光的。在从它的祀变性后，寡核巧酸 烙解探针可W返回到其巧灭或弱巧光状态。因此，烙解探针-祀复合物的巧光强度W祀-依 赖性方式随着溫度增加而降低，产生不同的源自烙解峰的针对每个祀的烙解溫度值。在一 些实施方案中，寡核巧酸烙解探针的核酸序列包括多个取决于所述SNP核巧酸变异的预定 烙解溫度，其区分所述SNP核巧酸变异。在一些实施方案中，祀核酸包含含有一个或多个突 变的非保守区域，所述突变位于寡核巧酸引物与祀核酸杂交之处。在一些实施方案中，扩增 步骤在第二寡核巧酸引物的存在下进行。除非另外限定，本文所用的所有技术和科学术语具有如本专利技术所属邻域的普通技 术人员通常本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在样品中检测靶核酸中的单核苷酸多态性(SNP)的方法，该方法包括：‑ 进行扩增步骤，其包括使所述样品与包含第一野生型核酸序列的寡核苷酸引物接触，当任何靶核酸存在于所述样品中时产生扩增产物；‑ 进行杂交步骤，其包括使所述扩增产物与寡核苷酸熔解探针接触，所述寡核苷酸熔解探针包含具有预定熔解温度的第二野生型核酸序列，其中所述寡核苷酸熔解探针的第二野生型核酸序列与所述寡核苷酸引物的第一野生型核酸序列重叠，并在所述SNP所位于的靶核酸区域上，在一端延伸出来一个或多个核苷酸；和‑ 检测所述扩增产物中存在或不存在所述SNP，其中所述寡核苷酸熔解探针的预定熔解温度的降低偏移指示所述样品中存在所述SNP，而其中不存在所述寡核苷酸熔解探针的预定熔解温度的降低偏移指示所述样品中不存在所述SNP。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：JA约翰逊，
申请(专利权)人：豪夫迈·罗氏有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH