用于检测SEPT7P2-PSPH融合基因的引物对、探针以及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测SEPT7P2‑PSPH融合基因引物对和探针的组合产品，其中，所述引物对的一条引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，另一条引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明专利技术还公开了包含上述引物对和探针组合产品的试剂盒，以及SEPT7P2‑PSPH融合基因的检测方法。本发明专利技术针对SEPT7P2‑PSPH融合基因的检测设计了特异性引物和荧光探针，提高了对SEPT7P2‑PSPH融合基因检测的敏感性和特异性，假阳性低。

【技术实现步骤摘要】
用于检测SEPT7P2-PSPH融合基因的引物对、探针以及试剂盒
本专利技术属于分子生物学检测
，具体涉及一种用于检测SEPT7P2-PSPH融合基因的引物对、探针以及试剂盒。
技术介绍
鼻咽癌(Nasopharyngealcarcinoma，NPC)是一种地区分布极不均衡的恶性肿瘤，为恶性度较高的肿瘤之一，其发病率为耳鼻咽喉科恶性肿瘤之首。中国是鼻咽癌高发区，据世界卫生组织(WHO)国际癌症研究机构(IARC)的资料，在全球统计的年鼻咽癌新发病例64796人中，中国达28022人，占43.2％；除了广东省和华南其他四个高发省份湖南、江西、广西和福建之外，东南亚、非洲和地中海周围的一些国家也具有较高的发病率，这些人口加起来，鼻咽癌威胁人数超过4亿。据移民流行病学研究显示，中国高发区居民移居美国、澳大利亚等低发国家数年后，鼻咽癌发病率虽然有所下降，但仍远高于当地居民，因此鼻咽癌被俗称为“中国癌”(Chinesecancer)，提示虽然居住环境发生改变，但其自身的遗传素质很可能是鼻咽癌持续高发的重要因素之一。鼻咽癌(NPC)是一种多基因遗传性疾病(polygeneticdiseases)，其发病与遗传因素(遗传易感性)、EB病毒感染、环境因素、饮食习惯等多种致瘤因素有关。鼻咽癌发病部位隐蔽，特别是在咽隐窝及鼻咽顶壁处，早期症状不明显，容易延误诊断和治疗。许多专家学者一直致力于寻找有效的方法来辅助鼻咽癌的早期诊断，疗效观察及预后判断，但目前鼻咽癌的发病机制还不十分清楚，治疗效果也不理想，5年生存率仍徘徊在50％左右，其原因主要与鼻咽癌发病部位隐蔽、鼻咽部组织构成复杂，治疗方式较单一、缺乏特异性治疗药物有关，且不同的鼻咽癌患者在病理类型、肿瘤分化程度、就诊时病变严重程度、临床表现、体质状况、对放化疗敏感性方面都存在着不同程度的差异。伴随分子生物学技术的发展，与鼻咽癌相关的生物学标记愈来愈受到关注，如果能够找到这些人群易感的机制，鉴定一个或数个鼻咽癌易感基因，就可针对性地研制高危人群筛查试剂盒，早期诊断试剂盒，还可开发出特异的新靶点药物，不仅具有重要的理论价值和学术意义，还将具有重大的经济价值和社会效益。因此，寻找鼻咽癌早期诊断及预后相关的特异性分子标志物对实现鼻咽癌的早期诊断及个体化治疗具有深远意义。SEPT7P2(septin7pseudogene2,ENSG00000214765,synonyms:DKFZp313J1114,SEPT13,SEPT7B)，定位在7号染色体7p12.3，负链，有13个外显子，目前发现由于可变剪切可以有9种转录本，为假基因不编码蛋白。Septins家族是保守的GTP结合蛋白，能够作为dynamic,regulatablescaffolds募集其他蛋白，与膜动力、囊泡运动、凋亡、细胞骨架重组、感染、神经退行性变和肿瘤的形成密切相关。PSPH(PhosphoserinePhosphatase)属于磷酸转移酶亚家族，该基因表达的蛋白属于磷酸转移酶(phosphotransferases)亚家族，PSPH定位在7号染色体短臂7p11，调控L-丝氨酸合成的第三步和最后一步，催化依赖于镁离子的L-磷酸丝氨酸，也参与L-丝氨酸和L-磷酸丝氨酸的互换。这个酶负责L-丝氨酸合成第三步和最后一步，催化镁离子依赖的L-磷酸丝氨酸的水解，同时参与L-丝氨酸和L-磷酸丝氨酸的互换作用。涉及的生物通路主要是丝氨酸合成代谢和碳代谢通路.丝氨酸通路为蛋白、核酸、酯类的合成提供必须前体，所以该代谢对细胞增殖包括肿瘤细胞有重要作用。多年来已有报道从基因组和功能证明丝氨酸合成通路的激活引起肿瘤。Pubmed文献中报道，70％的三阴乳腺癌细胞株中丝氨酸合成通路都上调，调控丝氨酸和甘氨酸的合成，促进肿瘤生长，丝氨酸合成通路与肿瘤形成、转移有关。SEPT7P2和PSPH这两个基因相邻，均位于染色体7上，正常情况下是负链转录，当发生病变时，SEPT7P2基因的1号外显子exon1和PSPH基因的4号外显子exon4融合成通路的激活引起肿瘤。研究表明，SEPT7P2-PSPH融合基因可能存在于包括鼻咽癌在内的多种实体肿瘤内，但以鼻咽癌的检出率最高，SEPT7P2-PSPH融合基因患者具有鲜明的临床特征，提示该靶点是鼻咽癌特异性较高的分子标记物。SEPT7P2-PSPH融合变异日前已经被鉴定为鼻咽癌的一个独特的分子亚型。SEPT7P2-PSPH融合基因阳性患者有其独特的临床病理特征；针对这一靶点的检测，将有助于鼻咽癌早期诊断及开发特异的靶点药物并开启鼻咽癌靶向治疗的新领域。目前国际上检测融合基因常见的技术方法有：逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、荧光原位杂交(FISH)和免疫组织化学(IHC)等。RT-PCR是PCR的一种广泛应用的变形，在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。RT-PCR可能是确认融合基因的一种快速诊断方法，理论上，这种技术的优势在于其检测突变转录体的高敏感性，如发现扩增产物则意味着融合基因。但在临床实践中，该技术面临诸多挑战：(1)操作步骤繁琐，易污染；(2)福尔马林固定石蜡包埋的组织DNA高度片段化，不利于检测；(3)PCR结果常出现假阳性，很难作为常规临床检测方法。FISH是用特定荧光标记探针与靶DNA进行杂交，通过免疫细胞化学过程连接上荧光素标记物，在荧光显微镜下观察探针标记或位点的技术。FISH是检测融合基因更加特异的方法，其优势在于可商业开发系列探针，应用于检测融合基因。虽然FISH是一种敏感和特异的检测融合基因的方法，但也并非万无一失的，不同数量断裂信号的治疗策略以及结果判读目前仍无统一标准。此外FISH检测的实验操作较复杂，标本处理不当时较难以检出，易出现假阳性的结果，费用较高，需要一定的设备，使FISH在临床的应用不易推广。IHC是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。IHC的最大优势是检测肿瘤特异性抗原的表达而不丢失能鉴别正常组织和病理组织的细胞和组织结构特征。对于活检组织切片使用组织染色来检测蛋自表达，结果可能是微弱和局部的，同时IHC方法总是存在一定的主观性，对弱阳性结果的判断需要进一步用FISH等技术来验证。实时荧光定量PCR技术(rea1-timefluorescentquantitativePCR，FQ-PCR)于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出，它是一种在PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时，探针结合在DNA任一一条单链上；PCR扩增时，Taq酶的5’端-3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。该技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种引物对和探针的组合产品，其中，所述引物对的一条引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，另一条引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

【技术特征摘要】
1.一种试剂盒，其包含引物对和探针，其特征是：所述引物对的一条引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，另一条引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；所述探针的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团；所述荧光报告基团为FAM，荧光淬灭基团为MGB；所述探针的3’端还连接有二氢环化吲哚卟啉-三肽。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中，还包含PCR反应缓冲液和Taq酶。3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述引物对和探针溶于PCR反应缓冲液中，浓度均为5uM。4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中，还包含阳性对照，所述阳性对...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵琦，钟明，
申请(专利权)人：安徽达健医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34