本发明专利技术公开了一种敲除嗜热厌氧芽孢杆菌Thermoanaerobacterium calidifontis Rx1乙酸激酶基因的重组质粒，并通过构建重组载体pBSkpa，并把该载体导入上述菌株T. calidifontis Rx1中，利用同源重组原理将卡那霉素抗性基因（kanr）片段插入其pta/ack中间使其失活，以kanr作为正筛选标记获得突变菌株；利用该突变菌株提高乙醇产量，以木糖和纤维二糖为底物，乙醇的产量分别增加了0.6、1.1倍，为研究ack基因敲除后其生长和发酵的特性以及为进一步的代谢工程改造提供新的途径。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物基因工程领域，具体涉及一种用于敲除嗜热厌氧芽孢杆菌(Thermoanaerobacterium calidifontis Rxl)的乙酸激酶基因 ac々的重组质粒 pBSkpa，以及重组载体pBSkpa在构建高温厌氧菌T.calidifon tis Rxl乙酸合成途径的阻断重组菌株中获得的突变菌株T.calidifon tis Rxl Z\ ack。
技术介绍
木质纤维素是地球上最丰富的可再生生物资源，世界各国争相开发以木质纤维素为原料的生物乙醇生产技术。但是Saccharomyces cerevisiae, Zymomonas mobiIis等醇生产菌种不能合成纤维素和半纤维素降解酶，而且也不能利用来源于半纤维素组分的木糖等戊糖。与这些传统乙醇菌株相比，高温厌氧菌的底物利用范围广，不仅可以代谢来源于木质纤维素的五碳糖和六碳糖，也能有效利用纤维素和半纤维素的水解产物，还可以利用多聚糖，甚至可以直接利用木质纤维素中的纤维素和半纤维素；而且高温厌氧菌对ΡΗ、温度和环境的耐受范围较宽，这些特征都有利于商业化生产，利用高温厌氧菌发酵还能避免酵母菌发酵易被微生物污染的问题。但是高温厌氧菌的底物利用率低和乙醇产量低是阻碍其工业化的主要因素。Τ.Rxl是一株革兰氏阳性严格厌氧菌株，其生长温度范围为38-68°C，最适生长温度是50 - 55°C ;pH范围为4.5-8.0 (pH彡4.3或彡8.2不生长)，最适PH值是7.0 ;在最优的生长条件下，Rxl发酵木糖和葡萄糖，乙醇的产率达到了理论产值的81 %和58 %。其乙醇产量(〈40 g/L)还远达不到传统发酵菌的水平，必须进一步提高乙醇产量，才有可能达到商业化生产的要求。对于乙醇生产来讲，乳酸和乙酸是副产物，其生成途径可称作旁路代谢途径，它们不仅会与乙醇生成途径争夺碳源和还原力(NADH)，而且有机酸的积累对细菌的生长具有很强的抑制作用。目前提高高温厌氧菌乙醇产量的主要策略是采用基因敲除的手段敲除旁路代谢的关键酶基因乳酸脱氢酶基因(A*)和磷酸乙酰转移酶(Pte)基因。Desai等于2004年首次成功敲除了嗜热厌氧解糖杆菌(T.saccharolyticum)的乳酸脱氢酶基因(Idh),又在2008年完成了 T.saccharolyticum^^ 基因和磷酸乙酰转移酶基因(pia)连续敲除的工作，成功阻断了乳酸和乙酸的生成途径，获得突变菌株ALK2在7 %木糖培养基(55° C)中连续培养，最高乙醇浓度达33 g/L，乙醇得率为0.46 g/g木糖。最近该研究团队针对C.Merff1ceWiZffi开发了一种基于尿啼啶营养缺陷性的转化子筛选方法，并敲除了IdhM 基因，将所获突变株与上述工程菌株ALK2进行共培养，发酵微结晶纤维素(92 g/L)，146 h时乙醇浓度为38 g/L。Deng等在C.MerazoceWiM?中异源表达丙酮酸激酶，并敲除和indh (苹果酸脱氢酶基因)基因得到突变菌株YD02，发酵纤维二糖的乙醇产量是野生菌株的3倍。英国Taylor等以一种高乙醇耐受性的兼性厌氧高温菌热葡糖苷酶地芽孢杆菌(CfeoAaciWiAs1 thermoglucosidasius)为出发菌株，敲除基因的同时上调表达丙酮酸脱氢酶基因(/^%)，加快了丙酮酸代谢速率，获得了乙醇得率为0.42 g/g葡萄糖的突变株。本专利技术利用的高温菌是实验室筛选的革兰氏阳性严格厌氧高温芽孢杆菌。在专利技术中首先构建重组载体pBSkpa，通过高压电穿孔转化法把pBSkpa导入T.calidiforntis Rxl细胞中，通过同源重组插入失活的方式，成功敲除了合成乙酸的基因获得乙酸产量大幅度减少、乙醇产量增加的^ calidifontis Rxl Z\ ac彩ξ变菌株，并对该菌株进行了生长特点和发酵特性的研究，为进一步的代谢工程改造提供新的理论依据。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种敲除乙酸激酶基因的重组质粒，该载体包括卡那霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因上游的pta-up片段、卡那霉素抗性基因下游的ack-down片段，卡那霉素抗性基因序列包含其启动子； 其中所述Pta-up片段核苷酸序列如序列表I所示，ack-down片段核苷酸序列如序列表2所示。本专利技术另一目的是采用上述敲除乙酸激酶基因的重组质粒构建一株敲除乙酸激酶基因的突变菌株，该菌株的的乙酸激酶基因的开放阅读框(ORF)因为插入了卡那霉素抗性基因而破坏了其完整性，不能编码乙酸激酶，从而阻断了乙酸的生成途径，使碳通量流向乙醇来提高其产量；该突变株T.calidifon tis Rxl Z\ ac々在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为:CCTCC M 2015279，中国典型培养物保藏中心地址:中国武汉，武汉大学，保藏日期为2015年5月7日。本专利技术所使用的原始菌株T.calidiforntis Rxl已保藏在“中国典型培养物保藏中心”，保藏号分别为CCTCC M 2011109。本专利技术的另一目的是将T1.calidifontis Rxl Z\ ac々应用到乙醇的发酵生产中。为了实现本专利技术的上述目的，本专利技术提供了如下的技术方案: 1、构建重组载体pBSkpa (I)以pUC18-HTK质粒为模板PCR扩增卡那霉素抗性基因(々a//)，扩增产物与PMD19-T载体连接，再用I和I限制性内切酶双酶切TA克隆载体和pBluescript II SK (-)载体，分别纯化回收后用T4连接酶进行连接，并转化至大肠杆菌JM109，获得pBS-Kan 中间载体。(2)以r.call difornt is Rxl基因组DNA为模板，扩增ac々上游片段，获得0.5Kb的ack-down基因片段，将其连接到PMD19-T载体上，采利用Hiη? III和ZAo I限制性内切酶进行双酶切载体PMD 19-ack-down和pBS-KaY，酶切产物纯化回收后连接得到载体pBS-Kanr-ack-down。(3)以T.cali difornt i s Rxl基因组DNA为模板，扩增下游片段，获得1.2 Kb的pta-up基因片段，并将其连接到PMD19-T载体上，利用Sac I和Xba I限制性内切酶进行双酶切载体PMD19_pta_up和pBS-ack_down-Kanr，酶切产物纯化回收后连接得到载体pBS-pta-up-Kanr-ack-down，即基因敲除重组载体 pBSkpa0 2、Τ.calidiforntis Rxl感受态细胞的制备 在T.calidiforntis Rxl的生长初期加入异烟肼，使终浓度达到5_20 Ug/mL，继续55°C培养至為。。=0.4-1.0，收集细胞并用电转缓冲溶液洗涤1-5次，最后悬浮在100-200μ L电转缓冲溶液中。3、重组载体 pBSkpa 转入 T.calidiforn tis Rxl 细胞 高压电穿孔转化法转入重组载体pBSkpa，摇床中48°C培养4 h回复细胞，然后在含有50-250 μ g/mL卡那霉素的平板上涂布，厌氧罐中培养。4、突变菌株的筛选 待平板上长出单菌落，挑菌到含有50-100 μ g/mL的液体培养基中40-48 °C培养，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种敲除乙酸激酶基因的重组质粒，其特征在于：该载体包括卡那霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因上游的pta‑up片段、卡那霉素抗性基因下游的ack‑down片段，卡那霉素抗性基因序列包含其启动子； 其中所述pta‑up片段核苷酸序列如序列表1所示，ack‑down片段核苷酸序列如序列表2所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：伊日布斯，申冬玲，尚淑梅，李卫娜，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：云南;53
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