通过测量乙酸激酶和氨基甲酸激酶的活性检测的测支原体测定法制造技术

本发明专利技术涉及一种检测测试样品中存在支原体的方法，包括：（ｉ）提供测试样品；（ｉｉ）检测和／或测量该测试样品中乙酸激酶和／或氨基甲酸激酶的活性，所述活性指示了是否存在支原体污染。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于检测柔膜细菌家族成员的分析方法和材料，该柔膜细菌污染了测试样品比如来自细胞培养物的样品。在分类学上，柔膜细菌与其它细菌的区别在于不含细胞壁，该纲细菌被称为柔膜纲细菌(Razin等1998)。该纲成员概述于下表1中。表1柔膜细菌纲的主要特征和分类 在本申请上下文中，术语“支原体”意在包括柔膜细菌纲所有成员，而非仅仅支原体目。实际上，“支原体”是本领域指代所有柔膜细菌的常用术语。支原体作为人、哺乳动物、爬行动物、鱼类、节肢动物和植物的寄生虫广泛分布于自然界。它们是最小最简单的原核生物。它们没有坚硬的细胞壁且无法合成肽聚糖；因此它们对于抗生素比如青霉素及其类似物不敏感。支原体是从DNA的鸟嘌呤和胞嘧啶的分子百分含量较低的革兰氏阳性菌即乳酸杆菌、芽胞杆菌、链球菌和两种梭菌属经退化性进化而发展的。在进化过程中，柔膜细菌丢失了它们遗传信息的重要部分。正是这一有限的编码容量决定了需要寄生的生存方式。多数菌株是兼性厌氧生物，但还有一些是专性厌氧的，因此，它们的代谢与厌氧菌类似。已鉴定了超过180种柔膜细菌种，其中从细胞培养物中分离出了20种来自人、牛和猪的不同支原体和无胆甾原体种。其中，六个种引起了全部支原体感染中的95％；它们是口腔支原体(M.orale)、精氨酸支原体(M.arginii)、发酵支原体(M.fermentans)、唾液支原体(M.salivarum)、猪鼻支原体(M.hyorhinis)和莱氏支原体(A.laidlawii)。感染的主要原因是来自引入实验室的其它细胞系的交叉污染。在组织培养试剂比如血清产品中可发现有害的外源支原体。与细菌不同，支原体污染很少导致浑浊生长或明显的细胞损害。在接种七天后还可以从作用表面获得活的支原体，支原体还可穿过细菌-截留过滤器。在它们的最大种群阶段，上清液中可含有高达108个支原体/ml，与宿主细胞的比例为5∶1。如果存在，支原体在培养基中“生长”至可检测的浓度，然后它们也可被吸附到细胞表面。目前尚未定论的是支原体是否进入并在培养物中的哺乳动物细胞内并存活。支原体几乎可改变体外培养物的任一性质。它们耗尽培养物中的养分特别是精氨酸。受感染的真核细胞表现出异常的生长，在代谢和形态方面发生改变。某些生物学特性已经涉及毒性决定因素；这些包括向寄主细胞环境中分泌或引入支原体酶比如磷脂酶、ATP酶、溶血素、蛋白酶和核酸酶。支原体的主要问题是它们的污染通常是隐蔽的，不同于细菌检测，不易于显现出来。它们对抗生素的耐药性和透过常规灭菌过滤器的能力意味着它们可以逃避一般的细胞培养物防菌工艺。由于具有这些未被检测污染的负面影响，很明显对于任何细胞培养实验室而言必需进行持续筛选。大量研究已表明培养物中至少10％-15％的细胞已被支原体污染。(Rottem和Barile 1993，McGarrity和Kotani 1985)。大多数细胞生物生物学家认识到需要进行常规的支原体测试，但由于现有测试方法的成本和不准确性，这种想法迄今仍无法实现。可用于检测活的支原体的唯一准确的方法是培养微-有机体。但是，与它们的体外培养有关的困难已证明是难以克服的，因为它们的培养需要复杂的培养基(Razin等1998)。培养也被认为是最灵敏的方法，因为据说可以检测单一的活有机体。但是，高度专业的人员使用非常特定要求的培养条件需要花费两或三周时间才能得到结果。需要花费如此长的时间是因为需要将细胞培养成足够的数目由此形成菌落，然后可使用Dienes染色辨别。支原体可在琼脂上以及在肉汤培养物中培养，尽管使用标准琼脂或肉汤培养基时，一些菌落可能不能完全包埋，大多数支原体生成包埋在琼脂糖中具有特征性的“煎鸡蛋”外观的微观菌落。有一些菌株不能容易地利用标准的琼脂糖或肉汤培养物生长。这些菌株需要用于它们分离和鉴定的细胞-辅助培养物。后一方法有助于鉴定并检测吸附于宿主细胞表面的支原体种(Rottem和Barile1993)。但是，由于培养方法的复杂性，这些测试通常由支原体测试服务实验室完成。检测样品中支原体的一种较简单的方法是使用荧光染料测定DNA。最常使用的一种染料是4’6-二氨基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)，而Hoecsht染色被认为是可选的方法。取出细胞培养样品、固定并使用Hoechst 33258染色(邻苯二酰胺)染色并在落射荧光检测(Battaglia等1994，Raab 1999)。如果存在与细胞相关联的支原体，那么在细胞质中细胞核将显示被荧光结构围绕。阴性细胞仅在核内的细胞DNA被染色。对DNA染色结果的准确解释需要专业的眼光，还需要专业的设备即荧光显微镜。对外服务实验室通常采用PCR的方法检测支原体，其也是在具有适当设备的实验室中进行的。支原体PCR试剂盒中使用的引物退火至支原体基因组的保守区域，可以检测若干的支原体种(Raab 1999)。最易购得的PCR试剂盒需要通过琼脂糖凝胶电泳分析扩增的产物，经所得的带型确定存在的污染种属。但是带型的观察是主观性的。Roche(Raab 1999)的支原体PCR ELISA依赖不同的体系，而且无法鉴别不同的种属。该试剂盒包括地高辛-dUTP，并将PCR产物被俘获于包被有抗-地高辛-过氧化酶偶联物的微板中的孔表面。使用标准ELISA板计数器测量四甲_(TMB)的有色产物。基于腺苷磷酸化酶的活性，Life Technologies开发出了MYCOTECTTTM试剂盒，已发现腺苷磷酸化酶仅在哺乳动物细胞中小量(如果根本不存在)存在(Verhoef等1983)。该酶将6-甲基嘌呤脱氧核糖(6-methyl deoxiriboside，6-MPDR)转化为两种毒性产物(6-甲基嘌呤和6-甲基嘌呤核糖)。该测定需要将污染的细胞系加到生长于24孔组织培养板的指示细胞系中。加入6-MPDR底物且再生长3-4天后，加入结晶紫染料测试指示细胞的活力，其中支原体阳性导致这些毒性剂的生成。尽管报道了如果将培养基条件调整为利于支原体生长，能在每200,000个靶细胞中检测出1个支原体细胞(Whitaker等1987)，但这一体系的主要缺点在于工作强度大且费时。可以使用免疫测定法检测支原体抗原，应用抗支原体抗原的抗体。例如在临床样本(Daxboeck等2003)中检测肺炎支原体(M.Pneumoniae)，使用不同的抗体鉴定不同的种属。现有大量商售试剂盒，例如IDEXX实验室(US)，为检测对动物健康具有指征的大量支原体提供了酶联免疫吸附分析(ELISA)。大多数已知的测验至少需要24小时才能完成，需要昂贵的设备和大量的工作。此外，它们是菌株-特异性测定。均非一般性的，即，都无法一般性地检测支原体种。英国专利号2357336B描述了可用于检测细胞培养物中支原体的测定法。该测定法基于观察到支原体过度生成了大量的APT酶。支原体的ATP酶活性将大量细胞的或外部加入的ATP转化为ADP，使得ADP可被检测。因此，该测定法基于检测ADP，通过向样品中加入含酶试剂(包含丙酮酸激酶和烯醇丙酮酸磷酸、腺苷酸激酶、甘油激酶、肌激酶的组合；或肌酸激酶(creative kinase)和肌酸磷酸酯(creative phosphate)的组合)而进行检测，该试剂将ADP转化为A本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测测试样品中存在污染性支原体的方法，包括：（ｉ）提供测试样品；（ｉｉ）检测和／或测量该测试样品中乙酸激酶和／或氨基甲酸激酶的活性（Ｂ），所述活性指示存在污染性支原体；以及（ｉｉｉ）基于步骤（ｉｉ）中对所述活性的检测和／或测量确定测试样品被支原体污染。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：安东尼皮特，沙伦PM克劳奇，凯文J斯莱特，安妮科克斯，
申请(专利权)人：坎布里克斯生物科学诺丁汉有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[]