一种酯酶新基因及其重组表达体系制造技术

本发明专利技术提供了一种酯酶新基因Ｅｓｔ＿ｐ１及其重组表达体系。该基因克隆自中国南海海底１００米深海洋底泥的宏基因组文库。基因全长８９１ｂｐ，编码２９６氨基酸。构建成功大肠杆菌ｐＥＴ２８ａ－Ｅｓｔ＿ｐ１／ＢＬ２１重组表达体系。目的蛋白分子量为３３．５ｋＤ。以ｐＮＰ－丁酸酯为催化底物，证明Ｅｓｔ＿ｐ１是一个偏碱性的中温酯酶，对于短链酯类有极高的催化活力，适于脂化、转酯化等工业领域。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体地涉及不可培养微生物的基因 克隆及表达。
技术介绍
数量巨大的不可培养的微生物中蕴藏着丰富的资源优势，宏基因组的研究为挖掘这一资源优势提供了可靠的技术保障。95%的海 洋微生物在现有的实验条件下无法或很难实现人工培养，直接从环 境中提取DNA,建立理论上可以覆盖环境中所有微生物的遗传信息 宏基因组文库。在海洋深度100米以上的极端环境中获得的基因片 段，将这些基因异源表达，有可能得到具有应用价值的新基因。通 过构建海洋底泥宏基因组文库，保存海洋微生物的基因多样性，以 利于不同类型新型基因的研究与开发利用。脂肪酶和酯酶是重要的工业酶制剂品种，可以催化解脂、酯交 换、酯合成等反应，广泛应用于油脂加工、食品、医药、日化等工 业。不同来源的酯酶和脂肪酶具有不同的催化特点和催化活力。其 中用于有机相合成的具有转酯化或酯化功能的脂肪酶和酯酶的规模 化生产对于酶催化合成精细化学品和手性化合物有重要意义。当前能源危机备受人们的关注，传统化石能源已不能满足人类 的需求，通过脂肪酶生物催化作用合成生物柴油的技术，具有提取 简单、反应条件温和、醇用量小、甘油易回收和无废物产生、无污 染等优点。本专利技术拟从海洋底泥宏基因组文库中筛选抗逆性强，性质优良 的新型酯酶和脂肪酶基因，为生物柴油的转化和制备工艺提供备选 资源。专利技术人在前期的工作中，成功构建了我国南海0 100米深底泥宏基因组文库，该库容DNA达194MB，经酶切、连接和转化，共 获得118,000个含有外源基因片段的重组子，其外源片段长度在 1.0-8.0 Kb之间。建立了酯酶和脂肪酶的筛选模型，为下一步筛选提 供了技术保障。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新的酯酶基因，用于脂类降解及其他 油脂类化合物的生物转化。本专利技术从南海底泥宏基因组文库中，通过功能筛选获得一种新 的酯酶基因eW^ 7，其核苷酸序列如SEQIDNo.l所示。eW大小 为891 bp，石威基组成226A( 25.4%), 232C( 26.0% )， 247G( 27.7% ), 186T(20.9% )， 0其他(0.0%);编码蛋白大小为296aa,其氨基酸 序列如序列表SEQIDNo.2所示。将该基因序列在GenBank中进行 同源搜索，发现一个与之相似性最高为59%的蛋白来源于一株未培 养细菌的酯酶/脂肪酶(其在GenBank的注册号为ABQ11268)。结 构预测结果显示，Est_pl具有完整的a/卩水解折叠保守结构域(COG0596)，该结构域包含了丝氨酸、谷氨酸和组氨酸组成的催化 三联体，构成酯酶/脂肪酶的催化中心，归属于酯酶/脂肪酶超级家族(cl09107)。综上所述，EsU)l应为酯酶/脂肪酶超级家族(c109107) 一名新成员。将M^p7克隆到表达载体pET28a并转化大肠杆菌BL21(DE3)， 得到pET28a-Est_pl/BL21重组表达体系。摇瓶培养并诱导表达 Est_pl，经纯化后获得Est_pl， SDS-PAGE表明其表观分子量为 33.5kD，与预测值相符；通过酯酶活力测定表明Est_pl能够特异地 打断化合物pNP-丁酸酯的酯键；通过对Estjl的最适反应pH测定 表明，其最适反应pH值为pH8.57，偏碱性；通过对Estjl的最适 反应温度测定表明，其最适反应温度约为40°C。酶的动力学常数测定表明，Est_pl的最适底物为pNP-丁酸酯，对于酰基碳链较短酯类 的水解活力优于长链酯类。应当理解，在不影响Est一jDl蛋白活性的前提下，本领域技术人 员可对SEQIDNO: 2所示的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺 失一个或几个氨基酸获得具有同等功能的氨基酸序列。此外，考虑到密码子的简并性，例如可在其编码区，在不改变 氨基酸序列的条件下，或在其非编码区在不影响表达的条件 下，可对编码上述蛋白的基因序列进行修改。因此，本专利技术还包含 对SEQIDNo.l所示的核苷酸序列进行的替换、添加和/或缺失一个 或多个核苷酸，且编码上述蛋白的核苷酸序列。进而，本专利技术还提供一种含有上述基因的克隆载体或表达载体， 含有所述载体的宿主细胞。进一步，本专利技术还提供一种制备Estjl的方法，其是通过培养 含有上述表达载体的宿主细胞，从培养物中分离得到Est_pl。本专利技术还提供所述Estjl在催化解酯、酯交换或酯合成中的应 用。优选的反应pH值为pH8.57，优选反应温度为40。C。本专利技术从我国海洋底泥宏基因组文库中钓出新型酯酶基因不仅 为酯酶家族增添了新成员，发现该基因编码的蛋白具有优良的酶学 性质，可以应用于酶法合成酯产品，将有望成为补充和取代部分化 学合成产品的新生产工艺的备选者。该酶的生产，将会在生物柴油 制备(催化解脂，酯交换等反应)，废纸浆脱墨再生等工艺中显示其 重要的经济和社会价值。附图说明图1显示的是pNP的标准曲线；图2显示的是表达产物Est_pl各纯化阶段的SDS-PAGE图，其 中，M:低分子量蛋白Marker; CL:粗酶提取液；FL: NTA-Agarose 柱流出液；EL: Est_pl蛋白于50mM咪唑溶液洗脱；图3显示的是pH对Estjl活性的影响；图4显示的是温度对酯酶Estjl活性的影响；图5显示的是Est_pl在pNP-丁酸酯和pNP-癸酸酯底物条件下 的双倒数曲线图，其中图5A是测定底物为pNP-丁酸酯的Est_pl动 力学常数测定，图5B是测定底物为pNP-癸酸酯的Est_pl动力学常 数测定。具体实施方式以下实施例进一步说明本专利技术的内容，但不应理解为对本专利技术 的限制。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步 骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所 熟知的常规手段。实施例1 j57基因的获得1. 文库初筛将文库中的菌株稀释涂布在含有1%三丁酸甘油 酯的LB平板上，37"培养，1 2天后挑出产生透明圈的菌落备用；2. 文库复筛将挑取得菌株重新点接在含有1%三丁酸甘油酯 的LB平板上，37°C培养，1 2天后确定并挑选出产生透明圈的菌 落。3. 挑取产生透明圈的菌株进行液体培养，通过TIANGEN质粒 提取试剂盒提取质粒，送公司测序；4. 测序结果该质粒外源DNA插入片断大小为3650bp。通过 ORF Finder预测得到4段完整的ORF序列。其中，编码酯酶或脂肪 酶的基因eWj77位于插入片断的728 1618bp。eW大小为891 bp, 其核苷酸序列如序列表SEQIDNo.l所示编码蛋白大小为296aa。将 该基因序列在GenBank中进行同源搜索，发现一个与之相似性最高 为59%的蛋白来源于一株未培养细菌的酯酶/脂肪酶(其在GenBank 的注册号为ABQ11268)。结构预测结果显示，Est_pl具有完整的a/p水解折叠保守结构域(COG0596),该结构域包含了丝氨酸、谷氨酸 和组氨酸组成的催化三联体，构成酯酶/脂肪酶的催化中心，归属于 酯酶/脂肪酶超级家族(cl09107)。综上所述，Est_pl应为酯酶/脂 肪酶超级家族(clO需) 一名新成员。5、根据测序结果，设计引物进行PCR，得到MUW完整基因。 PCR引物本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酯酶，其氨基酸序列为：ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．２所示的氨基酸序列，或该序列经缺失、添加和／或替换一个或几个氨基酸且具有同等功能的氨基酸序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李颖，彭晴，关国华，王珍芳，李季伦，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]