检测K-ras基因突变的探针、引物、试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开一种检测K-ras基因突变的探针，该探针是与K-ras基因第13位密码子的突变型序列特异性结合的Taqman MGB荧光探针。本发明专利技术还公开了一种检测K-ras基因突变的引物及试剂盒，该试剂盒包括：与K-ras基因第13位密码子的突变型序列特异性结合的Taqman MGB荧光探针；用于扩增包含K-ras基因第13位密码子的核苷酸序列的引物对；针对野生型K-ras基因第13位密码子GGC设计的PNA。本发明专利技术还公开了一种K-ras基因突变的双荧光标记探针实时定量检测方法。本发明专利技术的试剂盒和检测方法，能同时定性和定量检测K-ras基因第13位密码子的突变，且灵敏度高、操作简便，具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，应用于生物科学研究和临床分子诊断，具体涉及一种检测K-ras基因第13位密码子突变的探针、引物、试剂盒及方法。
技术介绍
K-ras基因(GenBank:NC_000012)突变在多种癌症中都有表达，如胰腺癌、结肠癌、血癌、甲状腺癌、胆管癌、肺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、皮肤癌、精原细胞癌等，其中，K-ras基因突变尤其在胰腺癌及结肠癌的发生发展中起重要作用。已有文献报道，在胰腺癌组织、胰液或粪便、血液中、结肠癌组织中可检测出K-ras基因第12、13或61密码子点突变。研究表明，检测体细胞DNA中K-ras基因突变与否，可作为胰腺癌早期诊断的一种方法。95％的胰腺癌患者组织中存在K-ras基因突变，被认为是胰腺癌的早期事件，在一些实验中发现慢性胰腺炎、胆道结石及表面健康正常人等人群中也存在K-ras基因突变，通过单纯的定性分析，敏感性较差，无法区分疾病人群，定量分析能更好反映突变程度，以便于良恶性鉴别。目前临床应用较多的K-ras基因突变检测方法为限制性片断长度多态性分析法(RFLP法)、扩增受阻突变体系法(ARMS法)和高分辨率熔解曲线法(HRM)。RFLP法：原理是将PCR与限制性酶切相结合的方法。第一步PCR引物(K1-上游:5′-CTGAA TATAAACTTGTGGTAGTTGGACCT-3′与K2-下游:5′-TCAAAGAATGGTCCTGGACC-3′)通过单一碱基错配，在K-ras基因第12密码子上游引入BstNI酶切位点，第一步PCR反应中野生型与突变型基因同比扩增，之后内切酶BstNI破坏了野生型片断，在第二步PCR时主要就只能扩增突变型基因片断，使突变型基因片断“信号放大”，从而提高了检测基因突变的敏感性。该方法的缺点是：1.步骤烦琐,耗时费力，需要2天时间才能完成鉴定；2.这种方法只能作定性研究，只能明确是否存在K-ras基因突变，无法实现定量检测；3.存在第一轮酶切不完全及开放操作导致的假阳性；4.检测灵敏度有限，无法实现较低含量的检测(参见文献Watanabe H,et al.Detection of K-ras point mutations at codon 12in pure pancreatic juice for the diagnosis of pancreatic cancer by PCR-RFLP analysis,Pancreas 1996；12:18－24)。ARMS法：原理是根据3′端错配原则，在进行扩增反应时,若3′端碱基对形成错配，链延伸反应就会因3′，5′二磷酸二酯键形成的障碍而受阻，因此，只有模板链是特定的等位基因时，才会检测出特异的扩增产物。在ARMS的反应体系中，引物上标记2个不同荧光素，或加入荧光探针等方法都是以实时荧光PCR为基础的基因分型方法。该方法的缺点是：1.每种特异性引物或探针只能针对某一种基因突变类型进行鉴定，而K-ras基因在第12、13密码子的突变类型可有十余种，需要逐一检测；2.可能出现由于单一碱基错配造成的假阳性；3.无法避免引物错配导致的假阳性结果出现(参见文献Fox JC,et al.The detection of K-ras mutations in colorectal cancer using the amplification-refractory mutation system,Br J Cancer 1998；77:1267-74)。HRM法：本原理是根据不同核酸分子的GC含量、GC分布及碱基互补性差异，双链DNA分子在加热变性时会有自己熔解曲线的形状和位置，其极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度高，依据高性能荧光染料释放荧光信号，进而实现达到对单个碱基差异的区分。在SNP的检测中，SNP位点由于不匹配双链DNA在升温过程中会先解开，荧光染料从局部解链的DNA分子上释放，从荧光强度与时间曲线上就可以判断是否存在SNP，而且不同SNP位点、杂合子与否等都会影响熔解曲线的峰形，因此HRM分析能够有效区分不同SNP位点与不同基因型。HRM检测不受突变碱基位点和种类的局限，可以对未知突变、已知突变进行筛查、扫描，亦可用于短片段重复序列的分析。该方法缺点是必须依赖高精度PCR仪(LightCycler 480和Rotor-Gene 6000)和饱和性染料(LC Green、Eva Green等)，同时其检测灵敏度为3％，无法检出更低量的突变，使其应用受到限制(Soulieres D,Greer W,Magliocco A M,Huntsman D,Young S,Tsao M S,et al.KRAS mutation testing in the treatment of metastatic colorectal cancer with anti-EGFR therapies[J].Curr Oncol,2010,17Suppl 1:S31-S40)。肽核酸(PNA)是一类人工合成的、结构上类似于DNA及RNA的核酸类似物，呈电中性，其骨架由2-氨乙基甘氨酸取代了DNA的磷酸二酯糖，能侵入DNA双链形成稳定的PNA-DNA双螺旋而不发生静电排斥，因此可以用来抑制野生型K-ras基因的扩增反应。其较之传统DNA探针具有不少优点：1.PNA-DNA结合十分稳定，正确配对的DNA/PNA的稳定性远远高于相应的DNA/DNA，同时在PCR反应过程中PNA亦不会被其他酶所降解。2.对于错配的PNA/DNA，一个碱基的错配能造成其融解温度下降9-10℃左右。目前，肽核酸作为一种分子生物学工具已在疾病的诊断、治疗等领域得到应用(参见文献：张兵波等，PNA探针与DNA探针的系统比较A Systemic Comparison between PNA Probe and DNA Probe，《高分子通报》2006；9：62-68；Egholm M，et al.PNA hybridizes to complementary oligonucleotides obeying the Watson-Crick hydrogen-bonding rules，Nature,1993,365:566～568)。
技术实现思路
本专利技术要解决目前检测K-ras基因突变的方法存在不能同时定性和定量、操作繁琐、灵敏度低的技术问题，提供一种检测K-ras基因第13位密码子突变的探针、引物、试剂盒及方法，该方法通过一次PCR反应就能确定K-ras基因第13位密码子突变类型和突变量，且操作简便、灵敏度高。为了解决上述技术问题，本本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测K‑ras基因突变的探针，其特征在于，所述探针是与K‑ras基因第13位密码子的突变型序列特异性结合的Taqman MGB荧光探针，所述K‑ras基因第13位密码子的突变型选自：AGC、CGC、TGC、GAC、GCC、GTC。

【技术特征摘要】
1.一种检测K-ras基因突变的探针，其特征在于，所述探针是与K-ras基因第13位密码
子的突变型序列特异性结合的Taqman MGB荧光探针，所述K-ras基因第13位密码子的突变
型选自：AGC、CGC、TGC、GAC、GCC、GTC。
2.根据权利要求1所述的探针，其特征在于，所述探针包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3
所示序列的探针。
3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，所述SEQ ID NO:2探针上标记的荧光与SEQ 
ID NO:3探针上标记的荧光不同。
4.一种检测K-ras基因突变的引物，其特征在于，所述引物用于扩增包含K-ras基因第
13位密码子的核苷酸序列，该引物包括SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示序列的引物对。
5.一种检测K-ras基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
与K-ras基因第13位密码子的突变型序列特异性结合的Taqman MGB荧光探针，所述K-ras
基因第13位密码子的突变型选自：AGC、CGC、TGC、GAC、GCC、GTC；
用于扩增包含K-ras基因第13位密码子的核苷酸序列的引物对；
针对野生型K-ras基因第13位密码子GGC设计的PNA。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示序列的探针；
SEQ ID NO:...

【专利技术属性】
技术研发人员：李兆申，高军，金晶，李泉江，唐旖旎，朱艳萍，丁佳寅，诸娴，王玉琼，
申请(专利权)人：上海长海医院，
类型：发明
国别省市：上海;31