【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子检测
，具体是涉及一种用于定量检测组织、尿液、血清或血浆中是否含有K-ras突变型基因的试剂盒及其检测方法。
技术介绍
K-ras的突变激活是人类多种肿瘤细胞恶性转化的主要原因之一，有如分子开关，正常时能控制调控细胞生长的路径；发生异常时导致细胞增殖失控，并阻止细胞自我毁灭。K-ras基因突变多发生在第12、13密码子，这种异常在胰腺癌(75%-95%)、结直肠癌(40%-50%)和肺癌(20%-30%)等肿瘤组织中发生率较高，在这些肿瘤患者的血清或血浆中也常能检测到K-ras基因突变。目前，靶向治疗已经成为肿瘤临床治疗的重要手段。大量临床证据表明，K-ras基因发生突变的结直肠癌患者在接受西妥昔单抗、帕尼单抗等靶向药物治疗时效果很差，而K-ras野生型患者对这些靶向药物表现出良好的疗效。目前K-ras基因检测已被写入《美国国立癌症综合网络(NCCN)结直肠癌临床实践指南》，要求所有转移性结直肠癌患者都应检测K-ras基因状态，并且只有K-ras野生型患者才建议接受西妥昔单抗和帕尼单抗治疗。临床工作中并不是所有的病人都能获得肿瘤标本，尤其是一些复发和初发时已有远处转移，或者是处于癌症晩期、不能耐受手术的癌症患者，血清或血浆K-ras基因突变检测可为其提供用药指导。Gerlinger等(2012)对肿瘤异质性的专门研究表明，肿瘤组织不同部位的体细胞基因突变谱并不相同，提示血清或血浆K-ras基因突变检测有可能比采用単一的肿瘤活检组织进行检测更具有临床指导意义。越来越多的研究也表明，癌症病人的血清或血浆中能否检测到癌细胞逸出的突变DN...
【技术保护点】
一种检测K?ras基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如下成分：扩增引物对，TaqMan?MGB探针和PNA；其中，所述扩增引物序列如SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2所示；所述TaqMan?MGB探针序列如SEQ?ID?NO:3所示；所述PNA序列SEQ?ID?NO:4所示。
【技术特征摘要】
1.一种检测K-ras基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如下成分: 扩增引物对，TaqMan-MGB探针和PNA ； 其中，所述扩增引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:2所示; 所述TaqMan-MGB探针序列如SEQ ID NO: 3所示； 所述PNA序列SEQ ID NO:4所示。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述TaqMan-MGB探针5’端连接有FAM标记的荧光发光基团，3’端连接有MGB标记的荧光淬灭基团。3.ー种应用权利要求1所述试剂盒检测K-ras基因突变的方法，包括如下步骤: (1)提取待测样本DNA； (2)K-ras野生型及其突变型质粒标准品的制备 采集含有K-ras野生型DNA及其突变型DNA的样品，提取野生型DNA和突变型DNA，K-ras野生型DNA的序列如SEQ ID NO:5所示，所述K_ras突变型DNA为SEQ ID N0:6 SEQ ID NO: 12所示序列中的任意一种；野生型DNA用SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:2所示的引物对进行PCR扩增，PCR反应体系为: 原料名称终浓度 含 Mg2’PCR bufferIx dNIPs0.15 mMSEQ ID NO:1 所示引物0.4 pM SEQ ID NO:2 所示引物0.4Taq热启动_2.5U DNA 模板1-5 |iL加去离了水后的总体IR50 nL PCR 反应程序为:95° C 30s ；95° C 5s, 75° C20s，52° C 30s，进行 40 个循环；突变型DNA用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2所示的引物对及SEQ ID NO: 4所示PNA进行PCR扩增，PCR反应体系为: 原料名称终浓度PCE buffer(.含 Mg2i)IxdNTPs0.15 mMSEQ ID NCH所示引物0.4 _SEQ IDNO:2所示弓丨物0.4 pM PNA0.1 _Taq 热动酶2.5U DNA 校 K1-5 pLM1-)<离f水G的总体积50 pL PCR 反应程序为:95° C 30s ；95° C 5s, 75° C20s，52° C 30s，进行 40 个循环；通过琼脂糖凝胶电泳切胶回收DNA片段，并进行纯化，制备成浓度为3X 101°拷贝数/UL的野生型质粒和突变型质粒；将野生型质粒和突...
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