一种罗米地辛的分离纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种罗米地辛的分离纯化方法，其包含下列步骤：a.将含有罗米地辛的紫色色杆菌（Chromobacterium violaceum）的发酵液与大孔吸附树脂混合，搅拌至吸附完全；b.将吸附罗米地辛的大孔吸附树脂从发酵液中分离出来，上柱，清洗后洗脱，得洗脱液1浓缩，得浓缩液1；c.将所述的浓缩液1上样至大孔吸附树脂，上柱，洗涤后洗脱，洗脱过程中用HPLC进行检测，收集含有罗米地辛组分的洗脱液2，浓缩，得浓缩液2；d.将所述的浓缩液2萃取，得有机层，浓缩，得粗品；e.将所述的粗品精制，即得。本发明专利技术的分离纯化方法提取纯度较高，收率高，纯化工艺简单，成本较低。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种罗米地辛的分离纯化方法。
技术介绍
罗米地辛，英文名称为Romidepsin，是从紫色色杆菌（Chromobacterium violaceum）的发酵培养液中分离得到的一种天然多聚肽，其分子式为C24H36N4O6S2，分子量为540。罗米地辛是一种新型的组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂，HDAC是一类锌离子酰胺酶，在催化组蛋白脱乙酰基时，锌离子跟乙酰基上氧的水合物螯合形成过渡态，HDAC的过度或异常调控使组蛋白过度去乙酰化，染色体凝聚使转录受到抑制，引起相应基因表达下降，导致肿瘤病症发生。罗米地辛抗肿瘤机理为罗米地辛进入细胞后，由还原性谷胱甘肽（GSH）将其二硫键还原为巯基，巯基可竞争性结合HDAC上的Zn2+，使HDAC失效，从而达到抗肿瘤的目的。罗米地辛，a novel antitumor bicyclic depsipeptide produced byChromobacterium violaceum No.968.I.Taxonomy,fermentation,isolation,physico-chemical and biological properties,and antitumor activity公开了一种从紫色色杆菌（Chromobacterium violaceum）WB968发酵液中纯化罗米地辛的方法，该方法为将发酵完成的发酵罐于120℃下灭菌30min，得到的培养液加入硅藻土助滤，将得到的滤液用等体积的乙酸乙酯萃取两次。将得到的萃取液减压浓缩得到油状残余物。将油状残余物与硅胶（Kiesel Gel160，70～230目，E.merk生产）混合，混合物在甲醇中制成胶状物，蒸发去除溶剂，将得到的干粉进行柱层析。得到的洗脱液蒸发去溶剂得到干粉，再次进行柱层析。两次柱层析使用相同硅胶柱，硅胶与正己烷装柱（硅胶与正己烷的质量体积比为4:1），展开剂为正己烷、正己烷与乙酸乙酯的混合溶液和乙酸乙酯，所述的正己烷与乙酸乙酯的混合溶液中正己烷与乙酸乙酯的体积比分别为3:1、1:1和1:2。收集含有目的化合物的洗脱液，加压浓缩，得到淡黄色粉末的目的化合物，将其溶解在甲醇：二氯甲烷（v/v=10:1）溶液中，加入两倍体积的乙腈，室温保存，即得纯化的罗米地辛。该纯化方法最后罗米地辛的收率只有31%，工业化应用受到限制。EP2124990A1公开了一种从发酵液中分离罗米地辛的方法，该方法为将发酵液用硫酸调pH至2.5，将酸化发酵液加入Sepabeads SP850树脂。首先用自来水以及25%丙酮进行清洗，然后用65%丙酮进行洗脱。得到的洗脱液，用水稀释至含水量至75%。将溶液上柱至Diaion HP20SS。用25%丙酮以及40%丙酮进行清洗，用47%丙酮洗脱。通过反相HPLC分析洗脱液，将活性部分在中间收集器中合并。洗脱液加水稀释至含有80%水量，上柱至Diaion HP20，用20%丙酮水溶液进行洗涤，然后用丙酮进行洗脱。洗脱液进行真空浓缩，浓缩液加入乙酸乙酯，再浓缩。最后得到的浓缩液，溶解在乙酸乙酯中，添加到氧化铝树脂柱，用乙酸乙酯/丙酮与乙酸乙酯的混合溶液（其中乙酸乙酯/丙酮的体积比为2:8，乙酸乙酯/丙酮与乙酸乙酯的体积比为0.5:2）进行洗脱，分析收集有活性的洗脱液。洗脱液加入丙酮进行溶解，然后加入甲醇稀释，真空浓缩得到活性产物粗提取物，过滤收集活性产物晶体。将晶体用85%丙酮溶解，缓慢加水，使得沉淀析出。沉淀用15%丙酮进行清洗，-70℃真空干燥得到纯化的结晶。以上百分比为有机溶剂的体积：水和有机溶剂的体积。从上述两种方法可知，现有技术中罗米地辛的分离纯化方法分离纯化步骤过多，操作复杂，纯化过程使用的试剂与仪器过多，造成分离纯化的成本增加，吸附过程存在不可逆吸附，收率较低以及不能适用于工业上大规模的生产。
技术实现思路
本专利技术为了解决现有技术中罗米地辛的分离纯化方法存在分离纯化步骤过多，操作复杂，纯化过程使用的试剂与仪器过多，造成分离纯化的成本增加，吸附过程存在不可逆吸附性，收率较低以及不能适用于工业大规模生产的缺陷而提供了一种罗米地辛的分离纯化方法。本专利技术的分离纯化方法提取纯度较高，收率高，纯化工艺简单，成本较低。本专利技术提供了一种罗米地辛的分离纯化方法，其包含下列步骤：a.将含有罗米地辛的紫色色杆菌（Chromobacterium violaceum）的发酵液与大孔吸附树脂混合，搅拌至吸附完全；所述的大孔吸附树脂为非极性、弱极性和中等极性大孔树脂中的一种或多种；b.将吸附罗米地辛的大孔吸附树脂从发酵液中分离出来，上柱，清洗后洗脱，得洗脱液1，浓缩，得浓缩液1；所述的清洗的溶剂为水；所述洗脱的溶剂为有机溶剂，或有机溶剂与水的混合溶剂1；在所述的混合溶剂1中，所述的有机溶剂与水的体积比为3.5:6.5～6:4；所述的有机溶剂为酮类溶剂、醇类溶剂或腈类溶剂；c.将所述的浓缩液1上样至大孔吸附树脂，上柱，洗涤后洗脱，洗脱过程中用HPLC进行检测，收集洗脱液2，浓缩，得浓缩液2；所述洗涤的溶剂为有机溶剂与水的混合溶剂2，在所述的混合溶剂2中，所述的有机溶剂与水的体积比为1:9～5:5；所述洗脱的溶剂为有机溶剂与水的混合溶剂3，在所述的混合溶剂3中，所述的有机溶剂与水的体积比为3.5:6.5～7:3；所述的有机溶剂为酮类溶剂、醇类溶剂或腈类溶剂；d.将所述的浓缩液2萃取，得有机层，浓缩，得粗品；e.将所述的粗品精制，即得。步骤a中，所述的大孔吸附树脂与所述的发酵液的质量体积比较佳地为0.01g/mL～0.06g/mL。所述的搅拌的时间可为本领域常规的时间，以所述的发酵液与大孔吸附树脂吸附完全为止，所述的搅拌的时间较佳地为20～60min，更佳地为20～40min。所述的吸附完全较佳地为发酵液颜色变浅，更佳地为发酵液颜色由棕色变为乳白色，最佳地，通过HPLC检测至吸附完全。步骤a和/或c中，所述的大孔吸附树脂分别独立的为非极性、弱极性和中等极性大孔树脂中的一种或多种，较佳地为X-5、XAD-2、XAD-7、ADS-17、SP825、Diaion HP50、D101、HPD-100、HPD-300、AB-8、DA-201和HPD-400中的一种或多种，更佳地为X-5、XAD-2、XAD-7、HPD-100、HPD-300、AB-8、DA-201和HPD-400中的一种或多种，最佳地为SP825、Dia本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种罗米地辛的分离纯化方法，其特征在于，其包含下列步骤：a.将含有罗米地辛的紫色色杆菌（Chromobacterium violaceum）的发酵液与大孔吸附树脂混合，搅拌至吸附完全；所述的大孔吸附树脂为非极性、弱极性和中等极性大孔树脂中的一种或多种；b.将吸附罗米地辛的大孔吸附树脂从发酵液中分离出来，上柱，清洗后洗脱，收集含有罗米地辛组分的洗脱液1，浓缩，得浓缩液1；所述的清洗的溶剂为水；所述洗脱的溶剂为有机溶剂，或有机溶剂与水的混合溶剂1；在所述的混合溶剂1中，所述的有机溶剂与水的体积比为3.5:6.5～6:4；所述的有机溶剂为酮类溶剂、醇类溶剂或腈类溶剂；c.将所述的浓缩液1上样至大孔吸附树脂，上柱，洗涤后洗脱，洗脱过程中用HPLC进行检测，收集含有罗米地辛组分的洗脱液2，浓缩，得浓缩液2；所述洗涤的溶剂为有机溶剂与水的混合溶剂2；在所述的混合溶剂2中，所述的有机溶剂与水的体积比为1:9～5:5；所述洗脱的溶剂为有机溶剂与水的混合溶剂3；在所述的混合溶剂3中，所述的有机溶剂与水的体积比为3.5:6.5～7:3；所述的有机溶剂为酮类溶剂、醇类溶剂或腈类溶剂；d.将所述的浓缩液2萃取，得有机层，浓缩，得粗品；e.将所述的粗品精制，即得。...

【技术特征摘要】
1.一种罗米地辛的分离纯化方法，其特征在于，其包含下列步骤：
a.将含有罗米地辛的紫色色杆菌（Chromobacterium violaceum）的发酵
液与大孔吸附树脂混合，搅拌至吸附完全；所述的大孔吸附树脂为非极性、
弱极性和中等极性大孔树脂中的一种或多种；
b.将吸附罗米地辛的大孔吸附树脂从发酵液中分离出来，上柱，清洗
后洗脱，收集含有罗米地辛组分的洗脱液1，浓缩，得浓缩液1；所述的清
洗的溶剂为水；所述洗脱的溶剂为有机溶剂，或有机溶剂与水的混合溶剂1；
在所述的混合溶剂1中，所述的有机溶剂与水的体积比为3.5:6.5～6:4；所述
的有机溶剂为酮类溶剂、醇类溶剂或腈类溶剂；
c.将所述的浓缩液1上样至大孔吸附树脂，上柱，洗涤后洗脱，洗脱
过程中用HPLC进行检测，收集含有罗米地辛组分的洗脱液2，浓缩，得浓
缩液2；所述洗涤的溶剂为有机溶剂与水的混合溶剂2；在所述的混合溶剂2
中，所述的有机溶剂与水的体积比为1:9～5:5；所述洗脱的溶剂为有机溶剂
与水的混合溶剂3；在所述的混合溶剂3中，所述的有机溶剂与水的体积比
为3.5:6.5～7:3；所述的有机溶剂为酮类溶剂、醇类溶剂或腈类溶剂；
d.将所述的浓缩液2萃取，得有机层，浓缩，得粗品；
e.将所述的粗品精制，即得。
2.如权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤a中，所述
的大孔吸附树脂与所述的发酵液的质量体积比为0.01g/mL～0.06g/mL；所述
的搅拌的时间为20～60min；所述的吸附完全为发酵液颜色变浅。
3.如权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤a和/或c中，
所述的大孔吸附树脂分别独立的为X-5、XAD-2、XAD-7、ADS-17、SP825、
Diaion HP50、D101、HPD-100、HPD-300、AB-8、DA-201和HPD-400中的
...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡海峰，熊磊，
申请(专利权)人：上海医药工业研究院，中国医药工业研究总院，
类型：发明
国别省市：上海;31