一种靶向性抗肿瘤T细胞及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种靶向性抗肿瘤T细胞，包括靶向Mesothelin的嵌合抗原受体CAR‑Mesothelin和靶向CD19的嵌合抗原受体CAR‑CD19，该T细胞高效地靶向且杀伤胰腺癌细胞，并清除胰腺癌组织附近的B淋巴细胞，调控其周围的免疫微环境，达到更好的治疗效果。本发明专利技术还提供了该靶向性抗肿瘤T细胞的制备方法和应用。

A Targeted Anti-Tumor T Cell and Its Preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种靶向性抗肿瘤T细胞及其制备方法和应用
本专利技术涉及医学生物领域，特别涉及一种靶向性抗肿瘤T细胞及其制备方法和应用。
技术介绍
胰腺癌是一种恶性程度高、诊断和治疗都很困难的消化道恶性肿瘤，约90％为起源于腺管上皮的导管腺癌，其发病率和死亡率近年来明显上升。CAR-T(嵌合抗原受体T细胞)技术是一种新型免疫细胞疗法，它是将经过CAR改造的T细胞回输至人体，激活自身免疫系统，对肿瘤细胞进行杀伤，以达到清除恶性肿瘤细胞的目的，被认为最有可能彻底清除肿瘤细胞的方法。但目前CAR-T技术的应用还局限于白血病、骨髓瘤、淋巴瘤等血液系统肿瘤，在诸如胰腺癌等实体肿瘤中的应用较少，且在复杂的肿瘤微环境中，CAR-T细胞对肿瘤细胞的识别、杀伤能力大大降低，限制了其临床应用。
技术实现思路
鉴于此，本专利技术提供了一种针对胰腺癌的靶向性抗肿瘤T细胞及其制备方法和应用。该T细胞可高效靶向至胰腺癌细胞，并清除胰腺癌组织附近的B淋巴细胞，调控其周围的免疫微环境，达到更好的治疗效果。第一方面，本专利技术提供了一种靶向性抗肿瘤T细胞，所述靶向性抗肿瘤T细胞为带靶向Mesothelin的嵌合抗原受体CAR-Mesothelin和带靶向CD19的嵌合抗原受体CAR-CD19的双靶点嵌合抗原受体T细胞，或者为带所述CAR-Mesothelin的嵌合抗原受体T细胞和带所述CAR-CD19的嵌合抗原受体T细胞的混合，或者为带所述CAR-Mesothelin的嵌合抗原受体T细胞和带所述CAR-CD19的嵌合抗原受体T细胞的一种或多种与带所述CAR-Mesothelin和所述CAR-CD19的双靶点嵌合抗原受体T细胞的混合；其中，所述CAR-Mesothelin包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向Mesothelin的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，所述CAR-CD19包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向CD19的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列；其中，所述靶向Mesothelin的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列，所述靶向CD19的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQIDNO：2所示的氨基酸序列。其中，当所述靶向性抗肿瘤T细胞为带CAR-Mesothelin和CAR-CD19的双靶点CAR-T时，嵌合抗原受体CAR-Mesothelin和CAR-CD19的分布位置不作限定，可以是交替分布(例如ABAB…，AABABB…)或依次分布(例如AAAA…BBB…)，但两者之间并无共价连接，此时它们相应的Mesothelin单链抗体和CD19单链抗体之间也并无共价连接，这样可使它们保持较好的识别能力。上述“从氨基端到羧基端顺次连接”具体为：所述靶向Mesothelin的单链抗体或所述靶向CD19的单链抗体的氨基酸序列的羧基端与所述胞外铰链区的氨基酸序列的氨基端相连，所述胞外铰链区的氨基酸序列的羧基端与所述跨膜区的氨基酸序列的氨基端相连，所述跨膜区的氨基酸序列的羧基端与所述胞内信号区的氨基酸序列的氨基端相连。上述提及的Mesothelin(间皮素)是一种分子量为40kDa的细胞表面糖蛋白，高表达于多种肿瘤组织中，是早期胰腺癌的生物标识。但是靶向Mesothelin的CAR-T细胞对胰腺癌患者的治疗效果并不好，患者的预后会非常差。CD19是血液系统中B细胞系标志物，通过与B细胞上的B细胞受体的结合参与B细胞发育、细胞内信号传导等过程，CD19是B系恶性肿瘤(例如淋巴细胞白血病)较常用的靶点。而本专利技术上述靶向性抗肿瘤T细胞带有CAR-Mesothelin和CAR-CD19，其中，CAR-Mesothelin能较好地靶向地靶向到表达Mesothelin的胰腺癌细胞，进行胰腺癌细胞的杀伤；而带CAR-CD19的CAR-T细胞能很好地清除胰腺癌组织附近的B淋巴细胞，调控其周围的免疫微环境，避免胰腺组织被B淋巴细胞浸润，改善胰腺癌患者的预后情况。达到更好的治疗效果。可选地，所述靶向Mesothelin的单链抗体的编码基因包括如SEQIDNO：3所示的核苷酸序列，所述靶向CD19的单链抗体的编码基因包括如SEQIDNO：4所示的核苷酸序列。本专利技术所述靶向Mesothelin的单链抗体保留有对Mesothelin抗原的亲和活性，能够高效识别表面表达有Mesothelin抗原的肿瘤细胞。类似地，所述靶向CD19的单链抗体也保留有对CD19抗原的亲和活性，能够高效识别表面表达有CD19抗原的B系恶性淋巴细胞。可选地，所述靶向Mesothelin的单链抗体的氨基酸序列的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQIDNO:3所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQIDNO:3具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQIDNO:1。所述靶向CD19的单链抗体的氨基酸序列的编码基因同样应该考虑简并碱基。本专利技术中，所述CAR-Mesothelin中的胞外铰链区用于促进所述靶向Mesothelin的单链抗体与肿瘤细胞上的Mesothelin抗原结合；类似地，所述CAR-CD19中的胞外铰链区用于促进所述靶向CD19的单链抗体与肿瘤细胞上的CD19结合。可选地，所述胞外铰链区包括CD8α铰链区、CD28铰链区、CD4铰链区、CD5铰链区、CD134铰链区、CD137铰链区、ICOS铰链区中的一种或多种的组合。进一步可选地，所述胞外铰链区为CD8α铰链区。可选地，所述CD8α铰链区的氨基酸序列包括如SEQIDNO：9所示的氨基酸序列。可选地，所述CD8α铰链区的编码基因包括如SEQIDNO：10所示的核苷酸序列。可选地，所述CD8α铰链区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQIDNO:9所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQIDNO:10所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQIDNO:10具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQIDNO:9。本专利技术中，所述CAR-Mesothelin中的跨膜区用于固定所述靶向Mesothelin的嵌合抗原受体CAR-Mesothelin；类似地，所述CAR-CD19中的跨膜区用于固定所述靶向CD19的嵌合抗原受体CAR-CD19。可选地，所述跨膜区包括CD3跨膜区、CD4跨膜区、CD8跨膜区、CD28跨膜区中的一种或多种的组合。进一步可选地，所述跨膜区为CD8跨膜区。可选地，所述CD8跨膜区的氨基酸序列包括如SEQIDNO：11所示的氨基酸序列。可选地，所述CD8跨膜区的编码基因包括如SEQIDNO：12所示的核苷酸序列。可选地，所述CD8跨膜区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQIDNO:11所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQIDNO:12所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQIDNO:12具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQIDNO:11。本专利技术中，所述胞内信号区用于提供T细胞活化的信号，维持T细胞的生存时间和激活T细胞增殖信号通路。可选地，所述胞内信号区包括4-1BB信号区、CD3ζ信号区、ICOS信号区、CD27信号区、OX4本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种靶向性抗肿瘤T细胞，其特征在于，所述靶向性抗肿瘤T细胞为带靶向Mesothelin的嵌合抗原受体CAR‑Mesothelin和带靶向CD19的嵌合抗原受体CAR‑CD19的双靶点嵌合抗原受体T细胞，或者为带所述CAR‑Mesothelin的嵌合抗原受体T细胞和带所述CAR‑CD19的嵌合抗原受体T细胞的混合，或者为带所述CAR‑Mesothelin的嵌合抗原受体T细胞和带所述CAR‑CD19的嵌合抗原受体T细胞的一种或多种与带所述双靶点嵌合抗原受体T细胞的混合；其中，所述CAR‑Mesothelin包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向Mesothelin的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，所述CAR‑CD19包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向CD19的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列；其中，所述靶向Mesothelin的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，所述靶向CD19的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种靶向性抗肿瘤T细胞，其特征在于，所述靶向性抗肿瘤T细胞为带靶向Mesothelin的嵌合抗原受体CAR-Mesothelin和带靶向CD19的嵌合抗原受体CAR-CD19的双靶点嵌合抗原受体T细胞，或者为带所述CAR-Mesothelin的嵌合抗原受体T细胞和带所述CAR-CD19的嵌合抗原受体T细胞的混合，或者为带所述CAR-Mesothelin的嵌合抗原受体T细胞和带所述CAR-CD19的嵌合抗原受体T细胞的一种或多种与带所述双靶点嵌合抗原受体T细胞的混合；其中，所述CAR-Mesothelin包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向Mesothelin的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，所述CAR-CD19包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向CD19的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列；其中，所述靶向Mesothelin的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列，所述靶向CD19的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQIDNO：2所示的氨基酸序列。2.如权利要求1所述的靶向性抗肿瘤T细胞，其特征在于，所述靶向Mesothelin的单链抗体的编码基因包括如SEQIDNO：3所示的核苷酸序列，所述靶向CD19的单链抗体的编码基因包括如SEQIDNO：4所示的核苷酸序列。3.如权利要求1所述的靶向性抗肿瘤T细胞，其特征在于，所述CAR-Mesothelin的氨基酸序列包括如SEQIDNO：5所示的氨基酸序列，所述CAR-CD19的氨基酸序列包括如SEQIDNO：6所示的氨基酸序列。4.一种重组病毒载体，其特征在于，包括如权利要求1-3任一项所述的靶向性抗肿瘤T细胞中所述CAR-Mesothelin和/或CAR-CD19的编码基因。5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括如权利要求4所述的重组病毒载体。6.一种靶向性抗肿瘤T细胞的制备方法，其特征在于，包括：(1)分别提供靶向Mesothelin的嵌合抗原受体CAR-Mesothelin的编码基因和靶向CD19的嵌合抗原受体CAR-CD19的编码基因；所述CAR-Mesothelin的编码基因包括从5’端到3’端顺次连接信号肽的编码基因、靶向Mesothelin的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因和胞内信号区的编码基因；所述C...

【专利技术属性】
技术研发人员：张宏玲，钟春颖，
申请(专利权)人：深圳宾德生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44