稳定表达MAP3K8蛋白的PK-15细胞株及其构建和应用制造技术

本发明专利技术涉及稳定表达MAP3K8蛋白的PK‑15细胞株及其构建和应用。该细胞株命名为PK‑15/MAP3K8，保藏编号为CCTCC NO:C2018262。该细胞株的制备包括以下步骤：目的基因MAP3K8的合成，重组慢病毒载体Lv‑MAP3K8的构建，包装表达MAP3K8的慢病毒，慢病毒感染PK‑15细胞，筛选培养和鉴定获得稳定表达MAP3K8蛋白的PK‑15细胞株。和野生型PK‑15细胞相比较，利用PK‑15细胞大量表达MAP3K8可以显著抑制FMDV或SVV的复制。该细胞株的建立为研究猪源细胞中MAP3K8基因功能及其背后的分子机制提供了生物材料。

Construction and application of PK-15 cell line stably expressing MAP3K8 protein

【技术实现步骤摘要】
稳定表达MAP3K8蛋白的PK-15细胞株及其构建和应用
本专利技术属于生物
，具体涉及稳定表达MAP3K8蛋白的PK-15细胞株及其构建和应用。
技术介绍
稳定细胞系（StableCellLine），是指质粒整合到染色体上后，用相应的质粒DNA中的抗性标志来筛选该细胞系，就得到了稳定表达的细胞系。可将稳定表达外源DNA整合到宿主细胞染色体上，或者相当于附加子可持续存在，可使宿主细胞长期表达目的基因。慢病毒是逆转录病毒的一种，包括多种哺乳动物的免疫缺陷病毒。慢病毒感染细胞后能将基因整合到宿主细胞染色体上，并能稳定表达。因此，它常被改造为转基因的工具。在疾病治疗，转基因动物，动物疾病模型等方面发挥重要作用。慢病毒载体可以容纳较大的DNA片段，并可能感染多种处于分裂期和非分裂期细胞，该载体可以有效地将目的基因转入脑、肝脏、肌肉、视网膜等，不引起毒性或免疫反应。在细胞构建中可以将目的基因插入到慢病毒载体，通过慢病毒感染靶细胞将目的基因整合到靶细胞上，在细胞系构建中应用较多。随着动物转基因技术的不断进步和发展，转基因动物在家畜改良、医药卫生、生物制药等方面均具有广阔的应用前景。慢病毒载体作为一类来源于逆转录病毒的载体，能够将目的基因整合到宿主细胞染色体中，长期稳定表达外源基因，同时其具备转染效率高、可感染分裂期和非分裂期细胞、容纳外源性基因片段大等优点，是制备转基因动物的一种高效工具。PK-15细胞（PorcineKidneyEpithelialcells）也称PK15或PK（15），来源于猪肾，中文名为猪肾上皮细胞，正常的细胞形态为上皮样，贴壁生长。该细胞对多种病毒比较敏感，如猪圆环病毒（PCV）、猪细小病毒（PPV）、猪瘟病毒（CSFV）等，可应用于猪圆环病毒疫苗、猪细小病毒疫苗、猪瘟病毒疫苗等的制备。猪肾脏细胞PK15增殖能力取决于细胞取材、培养技术、培养条件等综合因素。PK-15细胞现已广泛应用于猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒和猪细小病毒等的分离、体外培养以及相关疫苗的生产中。目前未见可限制口蹄疫病毒（Foot-and-mouthdiseasevirus,FMDV）和塞内卡古病毒（Senecavalleyvirus,SVV）的PK-15细胞系的相关报道。MAP3K8又称TPL2，在不同的组织中都有着广泛的表达。该蛋白是一种丝氨酸－苏氨酸激酶。TPL2信号转导在先天性和适应性免疫以及在癌症中作为潜在的原癌基因起着重要作用。TPL2在先天免疫中的作用仅限于细菌感染模型，使用病毒、寄生虫进行的相关研究比较少。TPL2/MAP3K8已被认为是I型（IFN-α/β）和II型（IFN-γ）IFN的关键调节剂，是多种病毒感染途径的重要组成部分，以细胞类型特异性方式差异调节IFN-α/β和IFN-λ的诱导。研究报道在TPL2缺陷的小鼠胚胎成纤维细胞中水泡性口炎病毒（VSV）的复制增加（Schmid,S.;Sachs,D.etal.Mitogen-activatedproteinkinase-mediatedlicensingofinterferonregulatoryfactor3/7reinforcesthecellresponsetovirus.JBiolChem2014,289(1),299-311.）。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种稳定表达MAP3K8蛋白的PK-15细胞株及其构建和应用。本专利技术通过慢病毒表达系统，获得稳定表达MAP3K8蛋白的细胞株PK-15/MAP3K8。用FMDV或SVV感染构建的细胞株，该细胞株能抑制FMDV、SVV的复制。该细胞株的建立为病毒的分离和研究MAP3K8的生物学活性奠定了基础。本专利技术提供的稳定表达MAP3K8蛋白的PK-15细胞株，命名为PK-15/MAP3K8，其保藏编号为CCTCCNO:C2018261。本专利技术还提供了PK-15细胞株在抑制FMDV或SVV复制中的应用。本专利技术还提供了PK-15细胞株在猪源细胞中MAP3K8的基因功能及其分子机制的研究中的应用。本专利技术还提供一种稳定表达MAP3K8蛋白的PK-15细胞株的构建方法，具体包括以下步骤：步骤1：重组慢病毒载体Lv-MAP3K8的构建：将MAP3K8基因插入到慢病毒载体Lv-pCDH的MCS区；步骤2：包装表达MAP3K8的慢病毒：用293FT细胞包装Lv-MAP3K8病毒液；48小时后收集病毒液，过滤、保存备用；步骤3：慢病毒感染PK-15细胞：将步骤2得到的慢病毒感染PK-15细胞，8小时后终止；步骤4：筛选培养：感染48h后，进行药物筛选，48h～72h后更换培养基并传代，维持培养，鉴定，得到稳定表达MAP3K8蛋白的PK-15细胞株PK-15/MAP3K8。本专利技术还利用qRT-PCR验证通过以上步骤筛选到的细胞株PK-15/MAP3K8，结果表明MAP3K8在该细胞株中能够高效、稳定表达。本专利技术将PK-15/MAP3K8细胞株分别接FMDV、SVV，qRT-PCR结果显示，与野生型PK-15相比，细胞株PK-15/MAP3K8抑制了FMDV或SVV的复制。本专利技术具有以下有益效果：1、本专利技术利用慢病毒系统构建了稳定表达MAP3K8蛋白的PK-15细胞株，该细胞株的建立为研究PK-15细胞中MAP3K8基因功能及其分子机制提供了可靠的生物材料。2、本专利技术构建的稳定表达MAP3K8蛋白的PK-15细胞株，利用PK-15细胞大量表达MAP3K8可以抑制FMDV或SVV的复制，将PK-15/MAP3K8、野生型PK-15细胞均分别接FMDV和SVV，野生型PK-15中FMDV相对表达量高于PK-15/MAP3K8细胞中FMDV的相对表达量，差异显著；野生型PK-15细胞中SVV相对表达量高于PK-15/MAP3K8细胞中SVV的相对表达量，差异极显著。总之，构建的PK-15/MAP3K8细胞株具有明显的抗病毒作用，能显著抑制FMDV、SVV的复制。附图说明图1为细胞株pCDH-PK-15、PK-15/MAP3K8中MAP3K8的表达量对比图。图2为细胞株pCDH-PK-15、PK-15/MAP3K8的MAP3K8和β-actin的qRT-PCR产物电泳检测图。图3为MAP3K8剂量依赖性抑制FMDV复制图。MYC-TPL2表示MYC标签和MAP3K8融合表达产物。图4为接FMDV后，野生型PK-15和PK-15/MAP3K8细胞中MAP3K8蛋白的表达对比图，图中**表示p<0.01，***表示p<0.001。图5为PK-15/MAP3K8细胞与野生型PK-15中FMDV/GAPDHmRNA表达量对比图，图中*表示p<0.05，**表示p<0.01。图6为PK-15/MAP3K8细胞与野生型PK-15在接毒FMDV16h后的间接免疫荧光观察照片。A：感染FMDV16h的PK-15；B：感染FMDV16h的PK-15/MAP3K8。图7为PK-15/MAP3K8细胞与野生型PK-15中SVV/GAPDHmRNA表达量对比图，图中**表示p<0.01，***表示p<0.001。图8为PK-15/MAP3K8细胞与野生型PK-15在接毒SVV16h后的间接免疫荧光观察照片本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.稳定表达MAP3K8蛋白的PK‑15细胞株，其特征在于，该细胞株命名为PK‑15/MAP3K8，保藏编号为CCTCC NO:C2018262。

【技术特征摘要】
1.稳定表达MAP3K8蛋白的PK-15细胞株，其特征在于，该细胞株命名为PK-15/MAP3K8，保藏编号为CCTCCNO:C2018262。2.权利要求1所述的PK-15细胞株在抑制FMDV或SVV复制中的应用。3.权利要求1所述的PK-15细胞株在猪源细胞中MAP3K8的基因功能及其分子机制的研究中的应用。4.稳定表达MAP3K8蛋白的PK-15细胞株的构建方法，其特征在于，具体包括以下步骤：步骤1：重组慢病毒载体Lv-MAP3K8的...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑海学，张克山，郝军红，田宏，茹毅，李丹，朱紫祥，杨帆，刘湘涛，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃,62