基于水貂源Nectin4受体的犬瘟热病毒敏感细胞系、制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体而言，提供了一种基于水貂源Nectin4受体的犬瘟热病毒敏感细胞系、制备方法和应用。基于水貂源Nectin4受体的犬瘟热病毒敏感细胞系，保藏编号为CGMCC NO.17413。该细胞系为可以稳定表达水貂源Nectin4基因的Vero细胞系，细胞的犬瘟热病毒敏感性更好，分离的病毒效价稳定，不会发生适应性突变和毒力致弱的问题。本发明专利技术提供的制备方法，将含有优化水貂源Nectin4基因的转基因载体引入宿主细胞，筛选得到表达水貂源Nectin4受体的犬瘟热病毒敏感细胞系，其中，所用优化水貂源Nectin4基因的序列如SEQ ID NO.1所示。该方法操作简便，安全性高。

Canine Distemper Virus Sensitive Cell Line Based on Mink-derived Nectin 4 Receptor, Its Preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
基于水貂源Nectin4受体的犬瘟热病毒敏感细胞系、制备方法和应用
本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及一种基于水貂源Nectin4受体的犬瘟热病毒敏感细胞系、制备方法和应用。
技术介绍
犬瘟热是由副粘病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒属(Morbillivirus)的犬瘟热病毒(Caninedistempervirus，CDV)感染引起的多种动物共患传染病。CDV囊膜由Ⅰ型和Ⅱ型糖蛋白的融合(F)蛋白和血凝素(H)蛋白构成。CDV进入易感宿主需要细胞受体为介导，CDV-H蛋白与膜表面受体蛋白相结合并引起穿膜运动，CDV的细胞受体主要包括信号淋巴细胞激活分子(SLAM)和细胞黏附分子4(Nectin-4)，Nectin4作为CDV其中一个受体，在病毒粘附与侵染过程中起重要作用。病毒分离技术是对犬瘟热的诊断和病毒致病性研究的重要手段，然而CDV强毒体外培养时对大多数细胞的不敏感性极大限制了该技术的应用，研究证实，美洲狨猴B细胞(B95a细胞)为包括麻疹病毒(Measlesvirus，MV)和CDV等副粘病毒的敏感细胞，但由于B95a细胞是一种EB病毒(Epstein-Barrvirus，EBV)转化的细胞，在培养过程中会有分泌EB病毒的危险，应用其对病毒分离的实验须在Ⅱ级生物安全实验室进行，因此大大限制了其在CDV分离上的应用。目前，针对CDV野毒株的分离一般通过易感动物肺巨噬细胞与Vero(非洲绿猴肾细胞)或MCDK(犬肾上皮连续细胞)等传代细胞系共培养的方法，但此类方法除存在操作复杂、耗费时间长和分离得到病毒效价不稳定等缺点外，由于以上传代细胞为犬瘟热病毒非敏感细胞，对于分离到的犬瘟热病毒很可能在适应细胞的过程中发生了毒力基因的突变，造成病毒株的致弱。因此，建立一种快速且敏感的分离犬瘟热病毒的方法是当前犬瘟热诊断及其病毒致病性研究中的瓶颈和难点。近来，Seki等(2003)应用建立的稳定表达犬SLAM的Vero细胞系(Vero.DogSLAMtag)较Vero和B95a细胞更快速且敏感地从疑似犬瘟热病犬体内分离到犬瘟热病毒，该细胞系在接毒后12h即可产生明显CPE。分离得到的犬瘟热强毒效价稳定且具有明显的致细胞病变(CPE)，病毒主要结构基因的氨基酸序列也未发生适应性突变。此后，在国外该细胞系以其表达受体的稳定性和对CDV高度敏感性在CDV分离和致病性研究中得到广泛的应用。在国内，该细胞系被多家科研单位直接引进用于犬瘟热病毒研究。本实验室曾用BHK-21细胞(王雅文2018)成功构建稳定表达水貂的SLAM的细胞系，但是不同的受体SLAM和Nectin4序列的差异可能影响受体与CDV的相互作用，进而可能导致表达Nectin4宿主细胞对CDV易感性不同和病毒的分离效率的差异。因此，开发一种可以对犬瘟热病毒强毒株敏感分离并且对犬瘟热病例进行快速诊断的细胞系具有重要的意义。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
基于上述原因，本专利技术的第一目的在于提供一种基于水貂源Nectin4受体的犬瘟热病毒敏感细胞系，以缓解现有技术中犬瘟热病毒敏感细胞系不稳定，分离犬瘟热病毒效率低等技术问题。本专利技术的第二目的在于提供上述犬瘟热病毒敏感细胞系在培养和/或分离犬瘟热病毒强毒株中的应用。本专利技术的第三目的在于提供上述犬瘟热病毒敏感细胞系在犬瘟热病毒鉴定或制备犬瘟热病毒诊断产品中的应用。本专利技术的第四目的在于提供一种基于水貂源Nectin4受体的犬瘟热病毒敏感细胞系的制备方法，以缓解现有技术中使用病毒等操作不安全，要求高，操作繁琐，细胞系易产生致弱等问题。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一种基于水貂源Nectin4受体的犬瘟热病毒敏感细胞系，保藏编号为CGMCCNO.17413。上述犬瘟热病毒敏感细胞系在培养和/或分离犬瘟热病毒强毒株中的应用。上述犬瘟热病毒敏感细胞系在犬瘟热病毒鉴定或制备犬瘟热病毒诊断产品中的应用。进一步地，所述产品包括试剂或试剂盒。一种基于水貂源Nectin4受体的犬瘟热病毒敏感细胞系的制备方法，将含有优化水貂源Nectin4基因的转基因载体引入宿主细胞，筛选得到表达水貂源Nectin4受体的犬瘟热病毒敏感细胞系；所述优化水貂源Nectin4基因的序列如SEQIDNO.1所示。进一步地，所述优化水貂源Nectin4基因缺少信号肽序列和终止密码子序列。进一步地，所述宿主细胞包括Vero细胞系或MCDK细胞系，优选为Vero细胞系。进一步地，将优化水貂源Nectin4基因插入到含有HA标签和Igκ链信号肽的pDisplay载体中，得到含有优化水貂源Nectin4基因的转基因载体。进一步地，将含有优化水貂源Nectin4基因的转基因载体通过瞬时转染引入宿主细胞。进一步地，所述筛选包括抗生素梯度浓度压力选择和有限稀释法选择。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术提供的基于水貂源Nectin4受体的犬瘟热病毒敏感细胞系，保藏编号为CGMCCNO.17413。本专利技术首次从水貂胎盘中克隆得到Nectin4基因，并利用该基因制备得到基于水貂源Nectin4受体的犬瘟热病毒敏感细胞系。该细胞系为可以稳定表达水貂源Nectin4基因的Vero细胞系，选用水貂源Nectin4受体，细胞系对犬瘟热病毒敏感性更好，可以有效分离犬瘟热病毒，分离效率高，并且分离的病毒效价稳定，病毒遗传信息稳定，不会发生适应性突变和毒力致弱的问题。本专利技术提供的基于水貂源Nectin4受体的犬瘟热病毒敏感细胞系的制备方法，将含有优化水貂源Nectin4基因的转基因载体引入宿主细胞，筛选得到表达水貂源Nectin4受体的犬瘟热病毒敏感细胞系，其中，所用优化水貂源Nectin4基因的序列如SEQIDNO.1所示。该方法操作简便，安全性高，选用水貂源Nectin4受体，CDV的敏感性更高。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术水貂源Nectin4受体的犬瘟热病毒敏感细胞系的一种制备方法技术路线图；图2为实施例1中从母貂胎盘中克隆Nectin4基因的PCR结果图；图3为实施例1中重组质粒PEASY-blunt-zero-minkNectin4的酶切验证图；图4为实施例2中优化Nectin4基因的PCR结果图；图5为实施例2中重组质粒pDisplay-mNectin-4表达Nectin4蛋白的结果图；图6为实施例3中稳定表达mNectin4的细胞系的筛选结果图，其中，图A为Vero细胞，图B为G418筛选的细胞，图C为有限稀释法筛选第5天的细胞，图D为有限稀释法筛选第10天的细胞；图7为实施例3中稳定表达mNectin4的细胞系间接免疫荧光结果图，其中，图A为细胞系培养10代的间接免疫荧光结果，图B为细胞系培养15代的间接免疫荧光结果；图8为实施例3中稳定表达mNectin4的细胞系的Westernblot结果图；图9为实施例5中SD(14)7毒株接种到VMN细胞的结果图，其中，图A为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于水貂源Nectin4受体的犬瘟热病毒敏感细胞系，保藏编号为CGMCC NO.17413。

【技术特征摘要】
1.一种基于水貂源Nectin4受体的犬瘟热病毒敏感细胞系，保藏编号为CGMCCNO.17413。2.权利要求1所述的犬瘟热病毒敏感细胞系在培养和/或分离犬瘟热病毒强毒株中的应用。3.权利要求1所述的犬瘟热病毒敏感细胞系在犬瘟热病毒鉴定或制备犬瘟热病毒诊断产品中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂或试剂盒。5.一种基于水貂源Nectin4受体的犬瘟热病毒敏感细胞系的制备方法，其特征在于，将含有优化水貂源Nectin4基因的转基因载体引入宿主细胞，筛选得到表达水貂源Nectin4受体的犬瘟热病毒敏感细胞系；所述优化水貂源Nectin4基因的序列如SEQIDNO.1所示。6.根据权利要求5所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵建军，陶荣珊，张宇飞，陈杰，刘梦佳，
申请(专利权)人：中国农业科学院特产研究所，
类型：发明
国别省市：吉林,22