一种含有不稳定结构域的CAR-T细胞及其制备方法和调节CAR-T细胞功能方法技术

一种含有不稳定结构域的CAR‑T细胞及其制备方法和调节CAR‑T细胞功能方法，在CAR‑T细胞中含有不稳定结构域的编码基因，并且去除终止密码子的CAR基因的3’端与不稳定结构域的编码基因直接连接，构成融合基因；在CAR‑T细胞中表达上述融合基因编码的融合蛋白，该融合蛋白N端为CAR分子，C端为不稳定结构域，定位于细胞膜。本发明专利技术的含有不稳定结构域的CAR‑T细胞的制备方法，流程少，步骤易于操作，便于实现产业化；本发明专利技术公开的调节含有不稳定结构域的CAR‑T细胞功能的方法，只需加入不稳定结构域对应的小分子化合物即可调节CAR分子的数量，并且不稳定结构域的存在，不会影响CAR分子自身的功能。

A CAR-T Cell Containing Unstable Domains and Its Preparation and Functional Regulation

【技术实现步骤摘要】
一种含有不稳定结构域的CAR-T细胞及其制备方法和调节CAR-T细胞功能方法
本专利技术涉及免疫学和细胞生物学
，具体说是含有不稳定结构域的CAR-T细胞及其制备方法和调节CAR-T细胞功能方法。
技术介绍
在细胞免疫治疗领域，CAR-T疗法已成为研究热点，其主要原理为经嵌合抗原受体修饰的T细胞，可以特异性的识别肿瘤相关抗原，使效应性T细胞的靶向性、杀伤活性和持久性均高于常规应用的免疫细胞，并可克服肿瘤局部免疫抑制微环境并打破宿主免疫耐受状态。目前，随着研究的深入，人们越来越考虑CAR-T应用中的安全性问题，即如何精确控制CAR-T细胞引起的抗原活动(如细胞因子风暴等)，并减少其他可能引起的副作用，对CAR-T细胞的活性实现精细控制等。化学诱导的二聚体化技术CID即当加入小分子药物rimiducid时，会引起分开的两个单体结合，当每个单体上连接的激活或抑制原件靠近形成二聚体时，会起激活或抑制作用，最终实现用药物控制活性开关。CID技术结合CAR-T技术，即开发了自杀开关CIDeCAR和活性开关GoCAR-T，以提供比现有细胞免疫疗法更安全有效的方法。其中，自杀开关CIDeCAR技术是将引起细胞凋亡的自杀蛋白Caspase9连接到药物结合结构域单体上，当口服化学药物后，引起Caspase9二聚体化，从而被激活启动细胞凋亡程序，进而引发CAR-T细胞凋亡，从体内清除CAR-T，中止反应。而活性开关GoCAR-T技术是将CAR的共激活信号连接到药物结合结构域单体上，若不口服化学药物后，仅靠肿瘤细胞的接触不能启动CAR-T细胞，通过口服化学药物，可提供共激活信号，启动和激活CAR-T反应。近年来发展出来一种依赖于细胞内分解机器的蛋白调控系统，利用细胞膜可透过的小分子化合物配体和特定结构域来实现对感兴趣蛋白的调节，所谓的特定结构域，指蛋白相应的结构域编码基因经过突变后，在小分子化合物配体不存在的情况下，该结构域变的不稳定，易被细胞内蛋白酶体降解，而结合小分子配体后，该结构域趋于稳定，这样的结构域称为不稳定结构域(Destabilizingdomains；DD)。目前不稳定结构域一般和免疫调节因子连接，这些因子可能增强过继细胞疗法的功效，但需要精确控制以优化其治疗效果，目前的技术无法精确调控细胞发挥治疗作用的时间或细胞因子的表达水平，这使许多潜在的应用难以安全有效地部署，缺乏可调性也使得瞬时表达的强效蛋白难以安全表达。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术的目的是提供一种含有不稳定结构域的CAR-T细胞及其制备方法和调节CAR-T细胞功能方法。本专利技术为实现上述目的，通过以下技术方案实现：一种含有不稳定结构域的CAR-T细胞，在CAR-T细胞中含有不稳定结构域的编码基因，并且去除终止密码子的CAR基因的3’端与不稳定结构域的编码基因直接连接，构成融合基因；在CAR-T细胞中表达上述融合基因编码的融合蛋白，该融合蛋白N端为CAR分子，C端为不稳定结构域，定位于细胞膜。在CAR-T细胞中，由于不稳定结构域的特性，上述表达的融合蛋白易被蛋白酶体降解，导致细胞膜上CAR分子不能积累；当不稳定结构域对应的小分子化合物配体存在于CAR-T细胞中时，上述融合蛋白不被蛋白酶体降解，细胞膜上CAR分子得到积累。融合蛋白中不稳定结构域的存在，不会影响CAR分子自身的功能。本专利技术对不稳定结构域的种类和来源不进行限定，可以来源于文献报道或者操作者筛选得到。优选的一种含有不稳定结构域的CAR-T细胞，所述的不稳定结构域为二氢叶酸还原酶DHFR的不稳定结构域、FKBP12蛋白的不稳定结构域或基于雌激素受体配体结合结构域发展的不稳定结构域ERLBP。本专利技术还包括含有不稳定结构域的CAR-T细胞的制备方法，包括以下步骤：①将不稳定结构域的编码基因与CAR基因末端连接，构建融合基因；具体的，将不稳定结构域的编码基因置于CAR基因的3’端，连接构成融合基因；②将步骤①所得融合基因克隆插入慢病毒质粒；③包装病毒，制备携带融合基因的慢病毒；④用步骤③所得慢病毒感染T细胞并扩增。本专利技术还公开了调节含有不稳定结构域的CAR-T细胞功能的方法，加入不稳定结构域对应的小分子化合物。优选的调节含有不稳定结构域的CAR-T细胞功能的方法，当所述不稳定结构域为二氢叶酸还原酶DHFR的不稳定结构域，对应小分子化合物为甲氧苄啶TMP；当所述不稳定结构域为FKBP12蛋白的不稳定结构域，对应小分子化合物为Shied-1；当所述不稳定结构域为基于雌激素受体配体结合结构域发展的不稳定结构域ERLBP，对应小分子化合物为4-羟基他莫昔芬。本专利技术相比现有技术具有以下优点：在本申请所指的CAR-T细胞中，去除终止密码子的CAR基因的3’端与DD的编码基因直接连接，构成融合基因；该融合基因编码的融合蛋白，N端为CAR分子，C端为不稳定结构域；DD的不稳定特性直接传递给CAR分子，包含CAR分子在内的整个融合蛋白被细胞内蛋白酶体降解，导致细胞膜上CAR分子不能积累；在DD小分子配体存在的情况下，包含CAR分子在内整个融合蛋白不被蛋白酶体降解，细胞膜上CAR分子得到积累。融合蛋白中不稳定结构域的存在，不会影响CAR分子自身的正常功能。通过人为添加小分子这一简便方式，调节细胞膜上CAR分子的数量，进而改变CAR-T细胞的功能。本申请所述方法直接在蛋白水平上对CAR分子数量进行调节，调节快速。本专利技术的含有不稳定结构域的CAR-T细胞的制备方法，流程少，步骤易于操作，便于实现产业化；本专利技术公开的调节含有不稳定结构域的CAR-T细胞功能的方法，只需加入不稳定结构域对应的小分子化合物即可调节CAR分子的数量，并且不稳定结构域的存在，不会影响CAR分子自身的功能。附图说明图1小分子化合物调节含有不稳定结构域的CAR-T细胞功能的原理示意图；图2DD-CAR的序列结构(DD为不稳定结构域，ScFv为单链抗体)；图3小分子TMP调节DHFR-CD19CAR-T细胞表面的CAR分子数目；图4小分子TMP调节DHFR-CD19CAR-T细胞体内抗肿瘤效应；图5小分子Shield调节FKBP-CD19CAR-T细胞对Raji细胞的杀伤效应。具体实施方式本专利技术的目的是提供一种含有不稳定结构域的CAR-T细胞及其制备方法和调节CAR-T细胞功能方法，通过以下技术方案实现：一种含有不稳定结构域的CAR-T细胞，在CAR-T细胞中含有不稳定结构域的编码基因，并且去除终止密码子的CAR基因的3’端与不稳定结构域的编码基因直接连接，构成融合基因；在CAR-T细胞中表达上述融合基因编码的融合蛋白，该融合蛋白N端为CAR分子，C端为不稳定结构域，定位于细胞膜。在CAR-T细胞中，由于不稳定结构域的特性，上述表达的融合蛋白易被蛋白酶体降解，导致细胞膜上CAR分子不能积累；当不稳定结构域对应的小分子化合物配体存在于CAR-T细胞中时，上述融合蛋白不被蛋白酶体降解，细胞膜上CAR分子得到积累。融合蛋白中不稳定结构域的存在，不会影响CAR分子自身的功能。优选的一种含有不稳定结构域的CAR-T细胞，所述的不稳定结构域为二氢叶酸还原酶DHFR的不稳定结构域、FKBP12蛋白的不稳定结构域或基于雌激素受体配体结合结构域发展的不稳本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种含有不稳定结构域的CAR‑T细胞，其特征在于：在CAR‑T细胞中含有不稳定结构域的编码基因；并且去除终止密码子的CAR基因的3’端与不稳定结构域的编码基因直接连接构成融合基因，并在CAR‑T细胞中表达上述融合基因编码的融合蛋白，该融合蛋白位于细胞膜上。

【技术特征摘要】
1.一种含有不稳定结构域的CAR-T细胞，其特征在于：在CAR-T细胞中含有不稳定结构域的编码基因；并且去除终止密码子的CAR基因的3’端与不稳定结构域的编码基因直接连接构成融合基因，并在CAR-T细胞中表达上述融合基因编码的融合蛋白，该融合蛋白位于细胞膜上。2.根据权利要求1所述的一种含有不稳定结构域的CAR-T细胞，其特征在于：所述的不稳定结构域为二氢叶酸还原酶DHFR的不稳定结构域、FKBP12蛋白的不稳定结构域或基于雌激素受体配体结合结构域发展的不稳定结构域ERLBP。3.权利要求1所述的含有不稳定结构域的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：①将不稳定结构域的编码基因与CAR基因末端连接，构建融合基因；具体的，将不稳定结构域的...

【专利技术属性】
技术研发人员：张文，孙娇，刘江，唐东起，
申请(专利权)人：山东大学第二医院，
类型：发明
国别省市：山东,37