一种基因修饰的免疫细胞及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种基因修饰的免疫细胞及其制备方法和应用，所述免疫细胞过表达HIL‑6和/或L‑GP130。本发明专利技术通过在免疫细胞中处理/过表达/条件性诱导过表达HIL‑6或L‑GP130，免疫细胞的扩增、迁移和杀伤肿瘤的能力得到显著增强，不会对其他免疫细胞造成影响，不会引起或加剧全身性或者局部的炎症反应，在保持免疫效应和抗肿瘤效果的同时，降低了CAR T治疗的副作用，在治疗恶性肿瘤、艾滋病中具有潜在价值。

A Gene Modified Immune Cell and Its Preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种基因修饰的免疫细胞及其制备方法和应用
本专利技术属于生物
，涉及一种基因修饰的免疫细胞及其制备方法和应用，尤其涉及一种过表达HIL-6和/或L-GP130的免疫细胞及其制备方法和应用。
技术介绍
抗CD19嵌合抗原受体(CAR)T细胞(tisagenlecleucel和axicabtageneciloleucel)的临床应用已显示出其对CD19阳性B细胞恶性肿瘤具有显著的杀伤效果。但是，CART细胞治疗仍然存在多种问题。在白血病治疗方面，CART细胞治疗存在复发率高的问题，促进CART细胞的维持和记忆性T细胞的形成可能是解决该问题的技术突破口；此外，抗CD19的CART细胞的临床治疗研究结果显示，患者对CART细胞治疗的响应率与细胞因子释放综合征(CRS)的发生存在一定的正相关关系，而CRS又可能导致CART细胞相关的脑病综合征(CRES)等副作用，严重限制了CART细胞的临床应用；而在实体瘤治疗方面，CART细胞疗效差，目前尚未报道相关的临床研究突破。T细胞的活化与扩增需要有效的协调信号，包括T细胞受体(TCR)信号(第一信号)、共刺激信号(第二信号)和细胞因子信号(第三信号)。其中，携带第三信号的分子(如IL-12、IL-7和IL-15)显著改善了CART细胞的扩增、迁移、持久性和抗肿瘤功效。CRS以白细胞介素-6(interleukin6，IL-6)作为检测指标。IL-6作为趋化因子家族中的一种多效细胞因子，主要由单核巨噬细胞、Th2细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞生成。IL-6的靶细胞众多，生物效应复杂，可通过调节细胞生长、基因激活、增殖、存活和分化，引发广泛的细胞和生理反应，包括免疫反应、炎症、造血和肿瘤发生等。IL-6通过与非信号转导IL-6Rα结合形成蛋白复合体，随后与亚基糖蛋白130(Glycoprotein130，GP130)二聚化，通过转录因子、Janus激酶(JAKs)和信号转导子、以及转录激活因子(STATs)启动信号转导级联。其中，IL-6和IL-6R的结合包括膜结合(mIL-6R)和可溶性IL-6R(sIL-6R)两种，分别称为经典或非经典信号传导。现有技术通常采用IL-6单抗(PMID：27049586)或IL-1β单抗(PMID：29808007，PMID：29808005)抑制IL-6的作用，或者以IL-6和IL-6R为靶点(EP3305890A1、US20180369282A1、US15018797和US15106657)，抑制CART细胞治疗的副作用。然而，IL-6的作用机制复杂，具有两面性，片面地对IL-6进行抑制，可能会影响CART细胞的抗肿瘤作用。WO2017007985公开了采用IL-6治疗肿瘤的方法。然而单纯地采用IL-6治疗可能同时激活膜结合(mIL-6R)和可溶性IL-6R(sIL-6R)，mIL-6R多与非肿瘤杀伤相关，过多地激活mIL-6R可能会干扰免疫细胞的功能，同时损耗可溶性IL-6R的IL-6用量。早期报道显示IL-6在小鼠模型中具有抗肿瘤的作用，然而小鼠模型限制了IL-6副作用的发现。随着科技的发展，研究人员逐渐认识到IL-6不仅可以引起严重的副作用，而且全身性使用IL-6可以造成炎症微环境，引发患者的细胞因子风暴，促进肿瘤生长或者免疫逃逸。近期研究常采用IL-6受体单抗、敲除IL-6受体等方法来阻断IL-6的副作用(PMID：27076371)，然而，阻断IL-6会影响免疫细胞抗肿瘤作用的最大化，影响抗肿瘤治疗的效果。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种基因修饰的免疫细胞及其制备方法和应用，所述免疫细胞的扩增、迁移和杀伤肿瘤的能力得到显著增强，提高了在实体瘤中的浸润，在治疗实体肿瘤中具有潜在价值。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供了一种免疫细胞，所述免疫细胞过表达HIL-6和/或L-GP130。本专利技术中，复合型IL-6(hyperIL-6，HIL-6)为IL-6和IL-6Rα的蛋白复合物，糖蛋白130(Glycoprotein130，GP130)也称为CD130、IL6ST或IL6β，可与IL-6受体、IL-11受体、IL-12受体、IL-27受体、白血病抑制因子受体(LIF)、致瘤素M受体(OSM)、睫状神经营养因子(CNTF)、心肌营养素(cardiotrophin-1，CT-1)、类心肌营养素细胞因子(CLC)和Kaposi肉瘤相关的疱疹病毒白细胞介素6样蛋白(KSHV-IL6)结合。本专利技术中，在免疫细胞中处理/过表达/诱导过表达HIL-6或者L-GP130，降低了CART在治疗过程中的副作用，同时保留了抗肿瘤作用。优选地，所述HIL-6的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，或与SEQIDNO:1具有80％以上同源性的具有相同或相似活性的氨基酸序列。优选地，所述HIL-6的核酸序列如SEQIDNO:2所示。优选地，所述L-GP130的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示，或与SEQIDNO:3具有80％以上同源性的具有相同或相似活性的氨基酸序列。优选地，所述L-GP130的核酸序列如SEQIDNO:4所示。优选地，所述免疫细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞或巨噬细胞中的任意一种或至少两种的组合。优选地，所述T细胞包括CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+CD8+T细胞、NKT细胞或γδT细胞中的任意一种或至少两种的组合，优选为CD4+T细胞、CD8+T细胞或CD4+CD8+T细胞，进一步优选为Th1细胞、记忆性T细胞或中枢记忆性T细胞。优选地，所述免疫细胞修饰有一种或者两种以上的CAR分子和/或TCR分子。优选地，所述CAR分子的胞外scFv序列识别抗原包括5T4、α5β1-整联蛋白、707-AP、AFP、ART-4、B7H4、B7-H3、BAGE、β-联蛋白/m、Bcr-abl、MN/CIX抗体、CA125、CAMEL、CAP-1、CASP-8、CD4、CD19、CD20、CD22、CD25、CDC27/m、CD30、CD33、CD52、CD56、CD80、CDK4/m、CEA、CT、Cyp-B、DAM、EGFR、ErbB3、ELF2M、EMMPRIN、EpCam、ETV6-AML1、G250、GAGE、GnT-V、Gp100、HAGE、HER-2、HLA-A*0201-R170I、HPV-E7、HSP70-2M、HST-2、hTERT、hTRT、iCE、IGF-1R、IL-2R、IL-5、KIAA0205、LAGE、LDLR/FUT、MAGE、MART-1/melan-A、MART-2/Ski、MC1R、Mesothelin、肌球蛋白/m、MUC1、MUM-1、MUM-2、MUM-3、PSCA、NA88-A、PAP、蛋白酶-3、GPC3、p190minorbcr-abl、Pml/RARα、PRAME、PSA、PSM、PSMA、RAGE、RU1、RU2、SAGE、SART-1、SART-3、生存蛋白、TEL/AML1、PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM3、LAG3、TGFβ、TPI/m、TRP-1、TRP-2、TRP-2/INT2、VEGF、WT1、IL-13Rα2、CD本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞过表达HIL‑6和/或L‑GP130。

【技术特征摘要】
2019.04.03 CN 20191026770291.一种免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞过表达HIL-6和/或L-GP130。2.根据权利要求1所述的免疫细胞，其特征在于，所述HIL-6的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，或与SEQIDNO:1具有80％以上同源性的具有相同或相似活性的氨基酸序列；优选地，所述HIL-6的核酸序列如SEQIDNO:2所示；优选地，所述L-GP130的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示，或与SEQIDNO:3具有80％以上同源性的具有相同或相似活性的氨基酸序列；优选地，所述L-GP130的核酸序列如SEQIDNO:4所示。3.根据权利要求1或2所述的免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞或巨噬细胞中的任意一种或至少两种的组合；优选地，所述T细胞包括CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+CD8+T细胞、NKT细胞或γδT细胞中的任意一种或至少两种的组合，优选为CD4+T细胞、CD8+T细胞或CD4+CD8+T细胞，进一步优选为Th1细胞、记忆性T细胞或中枢记忆性T细胞。4.根据权利要求1-3任一项所述的免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞修饰有一种或者两种以上的CAR分子和/或TCR分子。5.根据权利要求4所述的免疫细胞，其特征在于，所述CAR分子的胞外scFv序列识别抗原包括5T4、α5β1-整联蛋白、707-AP、AFP、ART-4、B7H4、B7-H3、BAGE、β-联蛋白/m、Bcr-abl、MN/CIX抗体、CA125、CAMEL、CAP-1、CASP-8、CD4、CD19、CD20、CD22、CD25、CDC27/m、CD30、CD33、CD52、CD56、CD80、CDK4/m、CEA、CT、Cyp-B、DAM、EGFR、ErbB3、ELF2M、EMMPRIN、EpCam、ETV6-AML1、G250、GAGE、GnT-V、Gp100、HAGE、HER-2、HLA-A*0201-R170I、HPV-E7、HSP70-2M、HST-2、hTERT、hTRT、iCE、IGF-1R、IL-2R、IL-5、KIAA0205、LAGE、LDLR/FUT、MAGE、MART-1/melan-A、MART-2/Ski、MC1R、Mesothelin、肌球蛋白/m、MUC1、MUM-1、MUM-2、MUM-3、PSCA、NA88-A、PAP、蛋白酶-3、GPC3、p190minorbcr-abl、Pml/RARR、PRAME、PSA、PSM、PSMA、RAGE、RU1、RU2、SAGE、SART-1、SART-3、生存蛋白、TEL/AML1、PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM3、LAG3、TGF3、TPI/m、TRP-1、TRP-2、TRP-2/INT2、VEGF、WT1、IL-13RIN、CD123、GUCY2C、NY-Eso-1或NY-Eso-B中的任意一种，优选为CD19、MUC1、GPC3、Mesothelin、PSCA或HER2中的任意一种；优选地，所述抗CD19CAR的scFv1的氨基酸序列如SEQIDNO:5所示，核酸序列如SEQIDNO:6所示；优选地，所述抗CD19CAR的scFv2-7的氨基酸序列如SEQIDNO:7-12所示；优选地，所述抗GPC3CAR的scFv的氨基酸序列如SEQIDNO:13所示，核酸序列如SEQIDNO:14所示；优选地，所述抗MUC1CAR的scFv的氨基酸序列如SEQIDNO:15所示，核酸序列如SEQIDNO:16所示；优选地，所述抗Mesothelin的scFv的氨基酸序列如SEQIDNO:17所示，核酸序列如SEQIDNO:18所示；优选地，所述抗PSCA的scFv的氨基酸序列如SEQIDNO:19所示，核酸序列如SEQIDNO:20所示；优选地，所述抗HER2的scFv的氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：深圳市体内生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44