一种从全基因组中筛选肝癌抑癌基因的方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种从全基因组中筛选肝癌抑癌基因的方法及其应用，所述方法包括如下步骤：(1)制备CRISPR

【技术实现步骤摘要】
一种从全基因组中筛选肝癌抑癌基因的方法及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种从全基因组中筛选肝癌抑癌基因的方法及其应用。

技术介绍

[0002]在全球范围内，肝癌是癌症相关死亡的第四大原因，在新发病例数量方面排名第六。肝癌的5年生存率仅为18％，是胰腺癌之后死亡率排名第二的致死性肿瘤。由于肝脏是一类高度异质性的组织结构，肝癌也成了一类十分复杂的肿瘤。临床上，许多患者被确诊时已处于晚期，而现有的临床治疗方案都难以有效提高患者的生存率。因此，急需新的生物标志物和药物靶点来有效地治疗这种疾病。
[0003]目前，基因筛选已被广泛应用于肝癌的驱动基因的筛选中。转座子和慢病毒的随机插入突变可以诱导基因功能的增加或减少，能快速地识别肝癌的驱动基因，然而转座子和慢病毒的随机插入存在偏好性，因此，这类正向遗传筛选存在局限性。短发夹RNA(shRNAs)的RNA干扰筛选也被用于肝癌的研究，然而shRNA文库不能达到基因组规模的覆盖，而且RNA干扰不能完全敲除目的基因。
[0004]新一代基因编辑技术CRISPR
‑
Cas9以其操作简单和通用的独特优势，成为了开展正向遗传学筛选实验的强有力的工具。利用CRISPR
‑
Cas9技术建立与某类功能相关的sgRNA文库，通过功能性筛选、富集、PCR扩增及深度测序分析筛选功能相关的基因。目前，利用全基因组范围敲除的筛选系统存在细胞量的限制，其中原代肝脏细胞虽为最理想的肝细胞源，但其保存成本较高，难以体外扩增，其来源短缺同时涉及伦理问题，因此，不适合作为修饰细胞进行筛选。
[0005]基于肝癌转化的全基因组筛选研究仍局限于鼠源化肝脏细胞、肝癌细胞系或转分化类肝细胞，虽然动物源性肝细胞的来源较广，且具有正常肝细胞的功能，但是有发生免疫排斥及异种来源的反转录病毒感染的风险。此外，肿瘤肝细胞也存在有致瘤风险和肝功能不足等缺陷。
[0006]目前常用的小鼠肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)模型主要有化学诱导、移植和基因修饰等类型。这类小鼠HCC模型可以在原位诱导肝癌的发生，但存在稳定性差、造模周期长和非人源化模型的局限性。
[0007]因此，开发一种新的理想的肝细胞源和全基因组筛选肝癌抑制基因的方法，筛选获得新的生物标志物和药物靶点，对肝癌的临床治疗具有重要意义。

技术实现思路

[0008]针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种从全基因组中筛选肝癌抑癌基因的方法及其应用。通过所述从全基因组中筛选肝癌抑癌基因的方法能够筛选获得新的生物标志物和药物靶点，通过所述方法筛选到13种肝癌抑癌基因，对肝癌的临床治疗具有重要意义；本专利技术还提供了一种适用性广的转化肝细胞为永生化肝细胞的方法，所述方
法可以实现人肝细胞的体外大量扩增，同时还可保留其正常肝细胞功能，所述方法制备的永生化肝细胞是新的理想的肝细胞源，能够作为筛选肝癌抑癌基因的工具细胞，具有广阔的应用前景。
[0009]为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0010]第一方面，本专利技术提供一种以非疾病诊断和/或治疗为目的从全基因组中筛选肝癌抑癌基因的方法，所述从全基因组中筛选肝癌抑癌基因的方法包括如下步骤：
[0011](1)制备CRISPR
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Cas9慢病毒和sgRNA文库慢病毒；
[0012](2)使用CRISPR
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Cas9慢病毒转染永生化肝细胞构建CRISPR
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Cas9稳定株；
[0013](3)使用sgRNA文库慢病毒转染所述CRISPR
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Cas9稳定株，得到sgRNA文库慢病毒感染的永生化肝细胞；
[0014](4)将所述sgRNA文库慢病毒感染的永生化肝细胞移植到免疫缺陷的小鼠体内，通过所述sgRNA文库慢病毒感染的永生化肝细胞筛选肝癌抑癌基因。
[0015]本专利技术中，所述从全基因组中筛选肝癌抑癌基因的方法首先将正常人肝细胞诱导为永生化肝细胞，提供一种用于筛选肝癌抑癌基因的工具细胞，再利用人类全基因组sgRNA文库筛选肝癌抑癌基因，最后利用人源化肝脏小鼠模型原位验证筛选所得候选基因的抑癌作用，为靶向肝癌治疗提供新的生物靶标，进一步为靶向肝癌治疗提供新的策略。
[0016]本专利技术利用人源化肝脏细胞在小鼠肝脏上形成的高度嵌合的人源化肝脏小鼠模型，对筛选所得的候选基因进行原位验证，可以一定程度上解决现存肝癌转化诱导模型不足的问题，同时可以还原肝脏的内环境，并更大程度地模拟人肝癌的发生和发展的过程。
[0017]优选地，步骤(1)中，所述CRISPR
‑
Cas9慢病毒和sgRNA文库慢病毒的制备方法包括如下步骤：
[0018]分别将含有CRISPR
‑
Cas9基因的慢病毒表达质粒和含有sgRNA文库的慢病毒表达质粒与病毒包装质粒共转染包装细胞，分别得到CRISPR
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Cas9慢病毒和sgRNA文库慢病毒。
[0019]优选地，所述含有CRISPR
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Cas9基因的慢病毒表达质粒包括lenti
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Cas9
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Blast质粒。
[0020]优选地，所述sgRNA文库包括GeCKOv2.0。
[0021]由于肝脏是一类高度异质化的组织，肝癌细胞的基因组也存在高度异质性，存在许多潜在的驱动突变。在本专利技术中，所使用的人类全基因组sgRNA文库为GeCKOv2.0文库，所述GeCKOv2.0文库靶向19050个编码蛋白质的基因以及1864条microRNA。与转座子和慢病毒随机插入技术相比较，所述GeCKOv2.0文库可以无偏倚地在全基因组范围内改变基因的表达和功能；与shRNAs干扰技术相比较，所述GeCKOv2.0文库能完全敲除目的基因，以减少目的基因未被完全敲低而对筛选结果产生的干扰。
[0022]优选地，所述病毒包装质粒包括psPAX2质粒和pMD2.G质粒。
[0023]优选地，所述包装细胞包括293T细胞。
[0024]优选地，步骤(2)中，所述使用CRISPR
‑
Cas9慢病毒转染永生化肝细胞构建CRISPR
‑
Cas9稳定株包括如下步骤：
[0025]将所述CRISPR
‑
Cas9慢病毒接种于永生化肝细胞培养液中孵育，进行抗生素筛选，得到CRISPR
‑
Cas9稳定株。
[0026]优选地，所述永生化肝细胞培养液的细胞密度为(1～2)
×
106cells/mL，例如可以
是1
×
106cells/mL、1.2
×
106cells/mL、1.4
×
106cells/mL、1.6
×
106cells/mL、1.8
×
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种以非疾病诊断和/或治疗为目的从全基因组中筛选肝癌抑癌基因的方法，其特征在于，所述从全基因组中筛选肝癌抑癌基因的方法包括如下步骤：(1)制备CRISPR
‑
Cas9慢病毒和sgRNA文库慢病毒；(2)使用CRISPR
‑
Cas9慢病毒转染永生化肝细胞构建CRISPR
‑
Cas9稳定株；(3)使用sgRNA文库慢病毒转染所述CRISPR
‑
Cas9稳定株，得到sgRNA文库慢病毒感染的永生化肝细胞；(4)将所述sgRNA文库慢病毒感染的永生化肝细胞移植到免疫缺陷的小鼠体内，通过所述sgRNA文库慢病毒感染的永生化肝细胞筛选肝癌抑癌基因。2.根据权利要求1所述的以非疾病诊断和/或治疗为目的从全基因组中筛选肝癌抑癌基因的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述CRISPR
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Cas9慢病毒和sgRNA文库慢病毒的制备方法包括如下步骤：分别将含有CRISPR
‑
Cas9基因的慢病毒表达质粒和含有sgRNA文库的慢病毒表达质粒与病毒包装质粒共转染包装细胞，分别得到CRISPR
‑
Cas9慢病毒和sgRNA文库慢病毒；优选地，所述含有CRISPR
‑
Cas9基因的慢病毒表达质粒包括lenti
‑
Cas9
‑
Blast质粒；优选地，所述sgRNA文库包括GeCKOv2.0；优选地，所述病毒包装质粒包括psPAX2质粒和pMD2.G质粒；优选地，所述包装细胞包括293T细胞。3.根据权利要求1或2所述的以非疾病诊断和/或治疗为目的从全基因组中筛选肝癌抑癌基因的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述使用CRISPR
‑
Cas9慢病毒转染永生化肝细胞构建CRISPR
‑
Cas9稳定株包括如下步骤：将所述CRISPR
‑
Cas9慢病毒接种于永生化肝细胞培养液中孵育，进行抗生素筛选，得到CRISPR
‑
Cas9稳定株；优选地，所述永生化肝细胞培养液的细胞密度为(1～2)
×
106cells/mL；优选地，所述CRISPR
‑
Cas9慢病毒的MOI为0.7以下；优选地，所述抗生素包括杀稻瘟菌素。4.根据权利要求1～3中任一项所述的以非疾病诊断和/或治疗为目的从全基因组中筛选肝癌抑癌基因的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述使用sgRNA文库慢病毒转染所述CRISPR
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Cas9稳定株，得到sgRNA文库慢病毒感染的永生化肝细胞包括如下步骤：将所述sgRNA文库慢病毒接种于所述CRISPR
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Cas9稳定株培养液中，孵育，抗生素筛选，得到sgRNA文库慢病毒感染的永生化肝细胞；优选地，所述CRISPR
‑
Cas9稳定株培养液的细胞密度为(2～2.5)
×
106cells/mL；优选地，所述sgRNA文库慢病毒的MOI为0.3以下；优选地，所述抗生素包括嘌呤霉素。5.根据权利要求1～4中任一项所述的以非疾病诊断和/或治疗为目的从全基因组中筛选肝癌抑癌基因的方法，其特征在于，步骤(4)中，将所述sgRNA文库慢病毒感染的永生化肝细胞移植到免疫缺陷的小鼠体内，通过所述sgRNA文库慢病毒感染的永生化肝细胞筛选肝癌抑癌基因包括如下步骤：将所述sgRNA文库...

【专利技术属性】
技术研发人员：ꢀ七四专利代理机构，
申请(专利权)人：深圳市体内生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：