一种B2m基因改造的免疫缺陷动物的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种能够特异的靶向B2m基因的sgRNA序列、构建免疫缺陷非人动物或其子代的方法及其在生物医药领域的应用。

A Method for Preparing B2m Genetically Modified Immunodeficient Animals and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种B2m基因改造的免疫缺陷动物的制备方法及其应用
本申请属于动物基因工程领域，涉及CRISPR/Cas9技术，具体涉及一种基于CRISPR/Cas9基因敲除技术获得免疫缺陷动物模型的方法以及用于特异性靶向B2m基因的sgRNA。
技术介绍
实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和开发药物是不可缺少的研究工具。其中，免疫缺陷动物由于缺乏免疫力，容易接受异种细胞或组织，在组织或细胞人源化动物研究、肿瘤药物及其他疾病的治疗机理方面已经得到广泛应用。已有研究表明作为受体鼠，目前普遍使用的免疫缺陷动物排序如下：NOD-PrkdcscidIL-2rγnul小鼠〉NOD-Rag1-/--IL2rg-/-(NRG)〉Rag2-/--IL2rg-/-(RG)〉NOD/SCID〉裸鼠，表明NOD-PrkdcscidIL-2rγnul小鼠是目前最佳的移植受体鼠(ItoRetal.CellMolImmunol.2012May；9(3):208-14)。然而NOD-PrkdcscidIL-2rγnull小鼠仍然存在缺陷，尽管由于该小鼠机体免疫功能严重降低，对人源细胞和组织几乎没有排斥反应，少量细胞即可成瘤(依赖于细胞系或细胞类型)，同时也没有B淋巴细胞泄漏，是最适合人源细胞或组织移植的工具小鼠，并已广泛用于新的人源化动物模型研发。但在免疫系统重建过程中，由于植入的是异种来源的成熟T细胞，小鼠会随时间推移而产生移植物抗宿主疾病(xenogeneicgraft-versus-hostdisease,X-GVHD)，已有研究表明1×106至2×107的人PBMC注入该小鼠体内，通常会在4周产生移植物抗宿主病反应(xenogeneicgraft-versus-hostdisease,X-GVHD)，最终导致NOD-PrkdcscidIL-2rγnul小鼠在移植后约20-50天内死亡，并存在明显的人T细胞浸润小鼠皮肤、肝、肠、肺和肾脏的表现，这使得该小鼠成为研究X-GVHD的有利模型(GolovinaTNetal.JImmunol.2008Aug15；181(4):2855-68；KingMAetal.ClinExpImmunol.2009Jul；157(1):104-18；NiwaAlietal.PLoSOne.2012；7(8):e44219)，但这极大地限制了功能性试验(如，药效研究)所能展开的周期，且对功能性研究的结果可能有影响，如，进行的药效检测可能不准确。另外有研究表明小鼠体内的NK细胞也会影响人PBMC的植入水平。主要组织相容性复合体(MHC)广泛参与免疫应答的诱导与调节，主要负责外来组织和细胞的免疫介导的排斥反应。有两种类型的主要组织相容性复合体，通常称为MHCI类和MHCII类，分别递呈多肽至CD8+T细胞或CD4+T细胞表面。文献及我们自己的研究都表明在NOD-PrkdcscidIL-2rγnul小鼠上利用人PBMC进行免疫系统重建，外周血细胞中99％以上为T细胞，其中又以CD8+T细胞为主，且GVHD发生后小鼠体内的CD8+T细胞出现明显降低(NiwaAlietal.PLoSOne.2012；7(8):e44219)，这表明鼠源MHCI类分子可能在上述X-GVHD的产生和发展过程中起了重要作用。人和小鼠均有I类MHC基因，编码的MHCI类分子由一条具有多态性的长肽链(称为重链)和一条通常不具有多态性的短肽链(称为轻链，即β2微球蛋白)组成(见图1)，两条链在细胞表面形成非共价的异源二聚体。β2微球蛋白作为一种非糖基化的蛋白，其主要功能之一在于稳定MHCI类的重链。此外β2微球蛋白可能还与一些淀粉样蛋白疾病相关，如阿尔兹海默症(Alzheimerdisease)、血液透析相关淀粉样变性(HRA)和威尔逊氏病(Wilsonsdisease,WD)。还有研究表明β2m缺陷与肿瘤及治疗性抗体如PD-1抗体的耐药性相关(ZaretskyJMetal.NEnglJMed.2016Sep1；375(9):819-29)。编码人β2微球蛋白(β2m)的B2m基因位于15号染色体，而鼠源的B2m基因位于2号染色体。目前已有部分β2微球蛋白缺失小鼠，最早是1989年ZijlstraM等人为了研究MHCI类分子的功能，利用同源重组方法，通过破坏B2m基因2号外显子，制备了不表达任何可检测的β2微球蛋白的小鼠，该小鼠健康具有正常的繁殖能力，体内CD4+8+T细胞和CD4+8-T细胞正常分布，但没有成熟的CD4-8+T细胞，且缺乏CD4-8+T细胞介导的细胞毒性。证实了MHCI类分子对胸腺中T细胞抗原受体CD4-8+T细胞阳性选择中具有重要作用(ZijlstraMetal.Nature.1989Nov23；342(6248):435-8.；ZijlstraMetal.Nature.1990Apr19；344(6268):742-6)。1997年Christianson等人将NOD/SCID小鼠与β2微球蛋白缺失的小鼠交配，得到β2m缺失的NOD/SCID小鼠(ChristiansonSWetal.JImmunol.1997Apr15；158(8):3578-86)，发现与NOD/SCID小鼠相比，该小鼠由于β2m缺失不存在MHCI类分子表达，NK细胞数量和活性降低，可支持更高水平的人PBMC植入，降低了人T细胞的X-GVHD反应。因此我们预计在免疫缺陷程度更高的NOD-PrkdcscidIL-2rγnull小鼠体内引入β2m缺陷，能进一步提升小鼠的免疫缺陷程度，有效的避免X-GVHD及提升小鼠移植后寿命。国际上杰克逊实验室(JacksonLaboratory，以下简称JAX)将其制备的NSG小鼠与NOD/SCIDB2m-/-小鼠杂交得到类似的小鼠(NerviBetal.ExpHematol.2007Dec；35(12):1823-38)。但制备过程使用的NSG小鼠是I型糖尿病NOD小鼠、重症联合免疫缺陷CB17-SCID小鼠、以及129背景的IL-2Rγ基因突变的小鼠杂交后，再与NOD-SCID小鼠回交至少10代以上得到(ShultzLDetal.JImmunol.2005May15；174(10):6477-89.)；而NOD/SCIDB2m-/-小鼠制备过程也是多背景交配，涉及的改造过程是通过在B2m基因2号外显子插入Neo基因片段，造成β2微球蛋白不能正常表达，这种改造方式引入了外源抗性片段，小鼠体内可能全身表达Neo抗性蛋白。鉴于用遗传交配及多代回交纯化方法构建的小鼠品系普遍存在制备周期漫长、背景不纯(多背景小鼠杂交、回交)、实验结果可重复性差等缺陷。因此本领域仍需一种更为简便的方法建立遗传背景清晰、免疫缺陷程度更高、实验周期更短、实验结果更稳定一致的B2m-/-免疫缺陷动物模型。由于免疫缺陷模式动物是肿瘤临床治疗研究重要的工具和保障，本专利技术旨在克服现有不足，提供一种小鼠细胞中与免疫相关的B2m基因ORF区全部敲除的、免疫缺陷程度更高的小鼠。该小鼠遗传背景单一，实验结果稳定可靠，移植后寿命长等优点。除可用于人源细胞移植生长以外，还可与多种细胞因子基因人源化小鼠配合用于新的人源化动物模型本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种构建免疫缺陷非人动物或其子代的方法，其特征在于，所述动物体内β2微球蛋白不表达或表达的β2微球蛋白不具有功能。

【技术特征摘要】
2018.01.19 CN 20181005437921.一种构建免疫缺陷非人动物或其子代的方法，其特征在于，所述动物体内β2微球蛋白不表达或表达的β2微球蛋白不具有功能。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，敲除动物体内B2m基因的全部或部分。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，敲除动物体内B2m基因的第1号外显子至第3号外显子的全部或部分。4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，使用基因编辑技术进行免疫缺陷非人动物或其子代的构建，所述基因编辑技术包括基于胚胎干细胞的基因同源重组技术、CRISPR/Cas9、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述的动物为免疫缺陷的；所述的动物为啮齿类动物；优选的，所述啮齿类动物为小鼠。6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，使用靶向B2m基因的sgRNA序列敲除动物体内B2m基因的第1号外显子至第3号外显子的全部或部分，其中，所述sgRNA序列靶向5’端靶位点序列如SEQIDNO：1-4任一项所示，3’端靶位点序列如SEQIDNO：5-8任一项所示。7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)制备获得sgRNA载体；2)将sgRNA载体的体外转录产物和Cas9mRNA进行混合，获得混合液，将混合液注射至非人动物或其子代受精卵细胞质或细胞核中，将注射后的受精卵转移至培养液中进行培养，然后移植至受体雌性非人动物或其子代的输卵管中发育，得到F0代非人动物或其子代；3)将F0代非人动物或其子代利用PCR技术进行检验，验证细胞中的B2m基因修饰成功，获得免疫缺陷阳性非人动物或其子代；4)将步骤3)筛选出的阳性动物通过杂交和自交的方式，扩大种群数量，建立稳定的免疫缺陷动物；优选的，所述步骤3)中使用的PCR检测引物对序列如SEQIDNO：14和SEQIDNO：15所示。8.根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于，所述动物用作动物模型；优选的，所述动物模型为荷瘤非人类哺乳动物模型。9.根据权利要求1-8任一所述的方法构建的免疫缺陷非人动物或其子代。10.一种经遗传修饰的细胞株，其特征在于，所述细胞株中不表达β2微球蛋白或表达的β2微球蛋白不具有功能。11.根据权利要求10所述的细胞株，其特征在于，所述细胞株中缺失B2m基因的全部或部分；优选的，所述细胞株中缺失B2m基因的第1号外显子至第3号外显子的全部或部分。12.一种靶向动物B2m基因的sgRNA序列，其特征在于，所述sgRNA序列在待改变的B2m基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG-3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列的排列规则。13.根据权利要求12所述的sgRNA序列，其特征在于，所述sgRNA序列在非人动物...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈月雷，白阳，郭朝设，郭雅南，张美玲，姚佳维，黄蕤，
申请(专利权)人：北京百奥赛图基因生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11