丝素水凝胶包裹的过表达ncRNA的MSC外泌体制备方法与在抗后肢衰老中的应用技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其涉及丝素水凝胶包裹的过表达ncRNA的MSC外泌体制备方法与在抗后肢衰老中的应用。本发明专利技术选用外泌体来传递ncRNA，进一步采用丝素蛋白水凝胶来包裹外泌体。实验表明，经包裹的外泌体能够缓慢和稳定的释放到细胞外基质中，提高了外泌体的滞留时间，并能够将过表达的ncRNA转运到细胞内。

Preparation of MSC exosome encapsulated by silk fibroin hydrogel for overexpression of ncRNA and its application in anti-aging of hind limbs

【技术实现步骤摘要】
丝素水凝胶包裹的过表达ncRNA的MSC外泌体制备方法与在抗后肢衰老中的应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及丝素水凝胶包裹的过表达ncRNA的MSC外泌体制备方法与在抗后肢衰老中的应用。
技术介绍
衰老和很多人类疾病相关，如心血管疾病，神经退行性疾病，癌症和代谢功能障碍等疾病。由于全世界有大量人口经受着这些疾病，同时衰老相关表型造成老年人异常虚弱，因此很多人对了解衰老的原因以及如何预防衰老过程有着浓厚的兴趣。比如在心脏衰老的过程中，活性氧和TGF-β信号途径增加，基质金属蛋白酶和基质金属蛋白酶组织抑制剂之间的失衡以及线粒体中积累的DNA突变，这将会导致心血管平衡发生变化，随后增加心肌细胞体积，降低心肌细胞数量，增加心肌胞外基质沉积特别是胶原蛋白，最后导致左心室肥厚，纤维化和心脏舒张功能障碍。因此如何延缓个体器官衰老成为全人类迫在眉睫的任务。目前涉及延缓衰老的相关治疗方法，例如，中药，运动和热量限制均通过减少产生有害的代谢副产物和激活“长寿途径”从而延长寿命。研究还发现，心脏祖细胞、心脏干细胞、胚胎干细胞和骨髓间充质干细胞来源的外泌体对心肌梗死后心脏发挥有益作用。此外非编码RNA(ncRNA)在心肌梗死和心脏衰老中发挥转录翻译后调控作用，特别是长度约22个核苷酸的微小RNA(miRNA)。一些异常表达的miRNA在心脏生理和衰老中发挥作用。例如，miR-34a在衰老的小鼠心脏和人类心脏中表达上调，沉默miR-34a会减少心肌细胞的凋亡，其机制是miR-34a通过靶定PNUTS影响DNA损伤反应途径从而减少端粒缩短和DNA损伤,下调miR-34a能明显延缓小鼠衰老状况。总之，对miRNA的研究表明，miRNA具有作为诊断衰老的标记物或治疗靶点的潜力。而心脏和后肢衰老过程中miRNA如miRNA-675均下调，并通过预测和实验验证该miRNA参与抑制衰老相关的的下游靶基因和分子通路。因此我们提出使用该miRNAmimics进行预防和延缓衰老。因为miRNA是短链核苷酸序列，因此通过miRNA对个体治疗无个体间差异，能避免外来分子造成的免疫原性。miRNA治疗是近年发展起来的一项新型临床前沿技术，其原理是通过将miRNA移植到接近衰老的组织或者缺血的后肢组织，从而下调衰老相关的蛋白，延缓后肢的衰老进程，进而促进血流恢复，后肢耐力等。裸露的miRNA容易受到血液组织液或细胞外基质内RNase的降解，因此提高miRNA运输到靶细胞的效率能进一步miRNA的治疗效果。目前常用的方法是采用miRNA分子进行治疗需要将miRNA分子与细胞外基质的酶隔离开来，以保证miRNA能稳定的运输到靶细胞内。目前常用的方法是将miRNA分子进行修饰(如锁核苷酸修饰)以及使用慢病毒过表达载体，纳米物质或水凝胶过表达miRNA载体或成熟的miRNA将其运输到靶定组织中。尽管最新研究表明，miRNA的锁核苷酸修饰和慢病毒过表达载体在传递miRNA时效果良好，但是锁核苷酸修饰对分子效果和后续的降解的影响未可知，而尽管慢病毒是在HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)病毒基础上改造而成的自身失活性的病毒载体系统，但是在大众的认知里直接注射慢病毒载体相对难以接受。因此使用对心脏有益的外泌体来递送miRNA，一方面避免了其与细胞外环境接触，另一方面，外泌体能和细胞膜融合或者被细胞内吞从而直接将miRNA递送到细胞内。由于衰老是一个自然而缓慢的过程，而使用外泌体传递miRNA的半衰期较短，而如何提高外泌体在组织中的滞留时间仍是研究的难点。为了模拟个体衰老过程中发生的细胞凋亡，增殖降低，炎症增加，身体机能下降等，我们拟采用小鼠后肢急性缺血模型来部分模拟组织的自然衰老。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供过表达ncRNA的外泌体及其制备方法与在制备促进缺血组织血流恢复和/或抗衰老的制剂中的应用，该外泌体具有良好的促进缺血组织血流恢复和/或改善血流的效果，制成制剂具有良好的缓释效果。本专利技术提供的过表达ncRNA的外泌体，所述ncRNA的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。本专利技术采用的ncRNA是一种miRNA，其是由长非编码RNA-lncRNAH19编码产生的，由22个核苷酸组成，命名为ncRNA-miR-675。本专利技术提供的过表达ncRNA的外泌体的制备方法为，由miRNAmimics转染间充质干细胞后，经培养制得；所述ncRNA的序列如SEQIDNO:1所示；所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。本专利技术中，所述培养采用去除外泌体的含有10％胎牛血清的α-MEM培养基。本专利技术中，所述培养后，收集上清液经分离获得过表达miRNA的外泌体。本专利技术提供的外泌体在制备促进缺血组织血流恢复和/或抗衰老的制剂中的应用。本专利技术还提供了一种促进缺血组织血流恢复和/或抗衰老的制剂，包括由丝素蛋白和本专利技术提供的外泌体制得的凝胶。本专利技术所述丝素蛋白与外泌体的质量比为20:0.55。本专利技术提供的促进缺血组织血流恢复和抗衰老制剂的制备方法为：将丝素蛋白水溶液经3次30％强度的超声，每次超声30s，然后与所述外泌体混合，35℃～40℃放置5min～10min，制成凝胶制剂。本专利技术实施例中，所述丝素蛋白水溶液的浓度为0.04g/mL。本专利技术实施例中，所述丝素蛋白水溶液的体积与外泌体的质量比为0.5mL：0.55mg。本专利技术选用外泌体来传递ncRNA，进一步采用丝素蛋白水凝胶来包裹外泌体。外泌体的天然膜结构能够起到隔绝ncRNA和细胞外基质的作用，外泌体通过和靶细胞融合或被靶细胞内吞而将其中的内含物释放到细胞内，这样外泌体中的内含物可以在不接触细胞外基质的情况下传递到靶细胞内。丝素蛋白作为一种天然的蛋白，提取方便，无免疫原性，且无需交联剂即可成胶，丝素蛋白水凝胶可以作为细胞支架，将细胞稳定的包封丝素蛋白水凝胶中，且基本不影响细胞的存活和状态。实验表明，经包裹的外泌体能够缓慢和稳定的释放到细胞外基质中，提高了外泌体的滞留时间，并能将ncRNA稳定的运送到细胞内。附图说明图1示丝素水凝胶包裹的过表达miR-675的UMSC外泌体的制备方法；图2示外泌体的流式细胞仪鉴定结果；图3示过表达miR-675的UMSC外泌体的miR-675的对应表达量；图4示去除丝胶前后的蚕丝的自发荧光；图5示超声后的丝素蛋白水溶液成胶后的不流动性，吸光度增加和可注射性；图6示小鼠左后肢肌肉中过表达miR-675的外泌体的荧光信号；图7示各组小鼠不同的时间点检测后肢血流恢复情况；图8示缺血后1个月检测不同处理组小鼠的跑步距离。具体实施方式本专利技术提供了过表达ncRNA的外泌体及其制备方法与在制备促进缺血组织血流恢复和/或抗衰老的制剂中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。本专利技术提供的过表达ncRNA的外泌体，所述ncRNA的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；所述间充质干细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.过表达ncRNA的外泌体，其特征在于，所述ncRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。

【技术特征摘要】
1.过表达ncRNA的外泌体，其特征在于，所述ncRNA的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。2.权利要求1所述过表达ncRNA的外泌体的制备方法，其特征在于，由miRNAmimics转染间充质干细胞后，经培养制得；所述ncRNA的序列如SEQIDNO:1所示；所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。3.根据权利要求1所述的外泌体，其特征在于，所述培养采用去除外泌体的含有10％胎牛血清的α-MEM培养基。4.根据权利要求1所述的外泌体，其特征在于，所述培养后，收集上清液经分离获得过表达miRNA的外泌体。5.权利要求1所述的外泌体或权利要求2～4任一项所述制备方法制备的外泌体在制备促进缺血组织血流恢复和/或抗衰老的制剂中的应用。6.一种促进缺血组织血流恢复和/或抗衰老的...

【专利技术属性】
技术研发人员：李杨欣，韩超珊，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32