一种表达BDDhFVIII基因的重组脂肪干细胞及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种表达BDDhFVIII基因的重组脂肪干细胞及其制备方法和应用，属于基因工程药物技术领域，所述重组脂肪干细胞通过将表达BDDhFVIII基因的腺病毒载体感染脂肪干细胞获得。所述制备方法包括以下步骤：构建表达BDDhFVIII基因的腺病毒载体；提取脂肪干细胞；将所述表达BDDhFVIII基因的腺病毒载体感染脂肪干细胞获得重组脂肪干细胞；所述重组的脂肪干细胞能够安全、持久的表达凝血因子VIII，对于血友病A的治疗具有较高的应用前景。

A Recombinant Adipose Stem Cell Expressing BDDhFVIII Gene and Its Preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种表达BDDhFVIII基因的重组脂肪干细胞及其制备方法和应用
本专利技术属于基因工程药物
，尤其涉及一种表达BDDhFVIII基因的重组脂肪干细胞及其制备方法和应用。
技术介绍
血友病A是临床上最常见的遗传性出血性疾病，由于编码凝血因子Ⅷ(FⅧ)的基因缺陷或功能异常所致。重型血友病A患者血浆中凝血因子活性水平小于1％(正常范围50％～150％)，极易出现自发性、轻微外伤后出血难止或创伤、手术后严重出血等。出血部位以深部肌肉及负重关节为主，治疗不彻底，易形成慢性疼痛及关节畸形。若发生中枢神经系统出血，死亡率极高。血友病A发病率约1/10000，中国人口基数大，据不完全统计，血友病发病人数已超过10,0000人，其中儿童及青中年患者所占比例极高，是儿童辍学率及青中年患者无业的重要原因。因此，血友病因其严重威胁着血友病患者的生活质量而越来越受到重视。在发达国家，目前血友病A的治疗为基因工程制品凝血因子Ⅷ预防性静脉输注，将血浆中FⅧ活性水平维持在1％以上，可以有效减少自发性出血频率，维持在5％以上即可使重型转为轻型。但无论是血浆中提取的或者是基因工程合成的重组凝血因子半衰期短，需频繁输注，其价格昂贵，给患者家庭及政府带来很大负担。在发展中国家，治疗主要为按需输注。血友病患者长期反复输注凝血因子替代治疗最大的副作用即是产生不可逆的抑制物，抑制物形成后替代治疗效率显著下降，出血风险再次增加。基于替代治疗是非治愈性方法，需终身用药，经济负担巨大，全世界超过70％的血友病病人无力承担使用凝血因子的巨额费用。因此，基因治疗是有望治愈血友病A的唯一途径。血友病A作为X染色体单基因遗传性出血性疾病，占血友病总数的80％～85％。当前的凝血因子替代治疗“治标不治本”且有局限性，只有从基因水平上矫正FⅧ基因缺陷才能彻底治愈血友病A。回顾国内外文献发现，血友病B基因治疗相对成熟，成功应用于临床，但血友病A基因治疗进展较慢，病毒载体及靶细胞选择尚未确定。血友病A较血友病B发病率高，临床出血严重，亟待基因治疗彻底改善症状。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种表达BDDhFVIII基因的重组脂肪干细胞及其制备方法和应用，所述表达BDDhFVIII基因的重组脂肪干细胞具有能够安全、持久的表达凝血因子VIII的优势。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：一种表达BDDhFVIII基因的重组脂肪干细胞，所述重组脂肪干细胞通过将表达BDDhFVIII基因的腺病毒载体感染脂肪干细胞获得。优选的，所述脂肪干细胞来源于腹股沟脂肪组织。优选的，所述腺病毒载体为AD5型腺病毒载体。本专利技术提供了所述的重组脂肪干细胞的制备方法，包括以下步骤：构建表达BDDhFVIII基因的腺病毒载体；提取脂肪干细胞；将所述表达BDDhFVIII基因的腺病毒载体感染脂肪干细胞获得重组脂肪干细胞。优选的，所述提取脂肪干细胞采用胶原酶消化法。优选的，所述脂肪干细胞提取自SD大鼠两侧的腹股沟脂肪组织。优选的，所述胶原酶消化的温度为36～38℃；所述胶原酶消化的时间为1～1.5h。优选的，所述提取脂肪干细胞之后还包括对提取获得的脂肪肝干细胞进行鉴定。优选的，所述感染的感染复数值为300～400。本专利技术还提供了所述的重组脂肪干细胞在制备防治血友病A的药物中的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的表达BDDhFVIII基因的重组脂肪干细胞，通过将表达BDDhFVIII基因的腺病毒载体感染脂肪干细胞获得。所述重组的脂肪干细胞能够安全、持久、有效的表达凝血因子VIII，对于血友病A的治疗具有较好的应用前景。附图说明图1为倒置显微镜下ADSCs的形态(×100)，其中A：原代培养48h；B：原代培养7d；C：3代ADSCs；图2为第三代ADSCs生长曲线；图3为倒置显微镜下ADSCs诱导鉴定(×100)，其中A：成骨诱导7d后ALP染色；B：成脂诱导14d后油红O染色；C：成骨诱导30d后茜素红染色；图4为流式检测第3代细胞表面标志结果；图5为倒置荧光显微镜观察感染后ADSCs细胞形态(×100)，其中A:正常ADSCs24h；B:Ad-BDDhFVIII-GFP感染24h；C:正常ADSCs48h；D:Ad-BDDhFVIII-GFP感染48h；E:正常ADSCs72h；F:Ad-BDDhFVIII-GFP感染72h；图6为实施例1中三组感染后对ADSCs增值影响；图7为实施例1中感染ADSCs72小时后hFVIIIAg水平；图8为实施例1中三组感染ADSCs后BDDhFVIII基因表达；图9为感染ADSCs72小时后hFVIII蛋白水平。具体实施方式本专利技术提供了一种表达BDDhFVIII基因的重组脂肪干细胞，所述重组脂肪干细胞通过将表达BDDhFVIII基因的腺病毒载体感染脂肪干细胞获得。在本专利技术中，所述脂肪干细胞优选的来源于SD大鼠，更优选的来源于SD大鼠腹股沟脂肪组织。在本专利技术中，所述腺病毒载体优选为AD5型腺病毒载体；所述腺病毒载体优选的表达绿色荧光蛋白的腺病毒载体。本专利技术对所述腺病毒载体的来源没有特殊限定，采用本领域常规方法制备获得或者采用市售的限定度载体均可。本专利技术提供了所述的重组脂肪干细胞的制备方法，包括以下步骤：构建表达BDDhFVIII基因的腺病毒载体；提取脂肪干细胞；将所述表达BDDhFVIII基因的腺病毒载体感染脂肪干细胞获得重组脂肪干细胞。在本专利技术中，所述构建表达BDDhFVIII基因的腺病毒载体优选的用腺病毒载体将BDDhFVIII基因包装获得表达BDDhFVIII基因的腺病毒载体。在本专利技术中，所述BDDhFVIII基因为B区缺失的人凝血因子VIII的基因，为缺失基因FVIII的2657-5141后的序列；所述BDDhFVIII基因的活性与功能均与未缺失B区的人凝血因子VIII基因一致。在本专利技术中，所述表达BDDhFVIII基因的腺病毒载体的构建方法参见汉恒生物科技(上海)有限公司的HB-infusion无缝克隆试剂盒；在本专利技术具体实施过程中，优选的委托汉恒生物科技(上海)有限公司构建。在本专利技术中，所述提取脂肪干细胞优选的采用胶原酶消化法；在本专利技术中，所述脂肪干细胞优选的提取自SD大鼠两侧的腹股沟脂肪组织。在本专利技术具体实施过程中，包括以下步骤：S1)SD大鼠腹腔麻醉、消毒后，分离两侧的腹股沟脂肪组织；S2)将所述脂肪组织清洗、剪碎后，进行胶原酶消化得到消化后的细胞；S3)将所述消化后的细胞进行筛网过滤、离心后收集固相组分即为脂肪干细胞。在本专利技术中，将SD大鼠腹腔麻醉、消毒后，分离两侧的腹股沟脂肪组织，本专利技术选择腹股沟脂肪组织分离的原因是腹股沟脂肪组织容易获取、产量大、来源充足；而其他地方的脂肪量少，不易获取或是提取过程中容易污染。本专利技术对所述腹腔麻醉的方法没有特殊要求，采用本领域常规的SD大鼠腹腔麻醉方法即可。在本专利技术中，所述消毒优选的采用酒精消毒，所述消毒具体为将SD大鼠浸泡于酒精中5～10min；所述酒精优选为体积分数75％的酒精。本专利技术在所述消毒后，采用镊子分离两侧的腹股沟脂肪组织。本专利技术在分离获得所述脂肪组织后，将所述脂肪组织清洗、剪碎后，进行胶原酶消化得到消化后的细胞。在本专利技术中，所述清洗的清洗液优选的为含体积分数1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表达BDDhFVIII基因的重组脂肪干细胞，其特征在于，所述重组脂肪干细胞通过将表达BDDhFVIII基因的腺病毒载体感染脂肪干细胞获得。

【技术特征摘要】
1.一种表达BDDhFVIII基因的重组脂肪干细胞，其特征在于，所述重组脂肪干细胞通过将表达BDDhFVIII基因的腺病毒载体感染脂肪干细胞获得。2.根据权利要求1所述的重组脂肪干细胞，其特征在于，所述脂肪干细胞来源于腹股沟脂肪组织。3.根据权利要求1或2所述的重组脂肪干细胞，其特征在于，所述腺病毒载体为AD5型腺病毒载体。4.权利要求1～3任意一项所述的重组脂肪干细胞的制备方法，包括以下步骤：构建表达BDDhFVIII基因的腺病毒载体；提取脂肪干细胞；将所述表达BDDhFVIII基因的腺病毒载体感染脂肪干细胞获得重组脂肪干细胞。5.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫振宇，谢燕燕，王霖虹，朱益文，
申请(专利权)人：华北理工大学，
类型：发明
国别省市：河北,13