含梯度细胞因子的细胞基质材料、其制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种含梯度细胞因子的细胞基质材料、其制备方法及应用。所述制备方法包括：构建包含细胞因子的编码基因的重组载体；将重组载体整合入宿主细胞，构建能够稳定表达细胞因子的重组细胞；以抗生素对重组细胞进行加药筛选，获得稳转细胞系；将稳转细胞系接种到基体上进行培养，并使在基体上培养出的重组细胞的分布密度沿指定方向梯度变化；将附着在基体上的重组细胞冻干，获得含梯度细胞因子的细胞基质材料。本发明专利技术提供的细胞基质材料可富集SDF‑1α，且其来源于细胞自身，可以最小化免疫反应，同时因其具有SDF‑1α因子梯度，可以在体外模拟体内的炎症微环境，并且还可为细胞附着提供支撑，使干细胞向炎症部位迁移。

Cell matrix materials containing gradient cytokines, their preparation methods and Applications

【技术实现步骤摘要】
含梯度细胞因子的细胞基质材料、其制备方法及应用
本专利技术涉及一种细胞基质材料，特别涉及一种含梯度细胞因子的细胞基质材料、其制备方法及应用，属于生物

技术介绍
生物支架材料是组织工程研究的热点之一，根据来源不同主要分为人工聚合材料和天然生物衍生材料两大类。其中天然生物衍生材料来源于生物组织，与人工聚合材料相比，具有更好的生物相容性和生物识别优势，因而成为组织工程研究热点。细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)是一种特殊的天然生物衍生材料，是通过特殊理化方法去除生物体原型组织中的细胞成分所制备的。近来研究表明，ECM的三维结构不仅是支撑组织、细胞生长的支架，还能诱导和调控细胞的黏附、生长、增殖和分化，并促进组织修复与再生。ECM的良好生物学性能使其在组织修复重建研究中得到广泛关注。ECM材料的来源主要有两大类：一种是有特定组织器官直接脱细胞制备而成；另一种则是由细胞衍生制备的ECM。大体流程为：首先体外培养细胞生产ECM，其次去细胞制备ECM，最后冻干保存ECM。现有的ECM的制备工艺已经相当成熟，但其存在一些不足和劣势，例如：(1)目前所建立的梯度平台，绝大多数是通过扩散、输注、微接触打印和微流控系统等研究细胞的行为以及不同因子间的相互作用，添加太多非生物物质；(2)目前所制备的ECM生物材料主要通过提取出单一ECM成分后包被其他材料来实现其特定功能；(3)生物体内是一个复杂的三维环境，细胞因子释放出后即形成向外扩散的梯度，现有的ECM生物材料忽视这一现象，无法准确模拟体内微环境对细胞的影响。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供一种含梯度细胞因子的细胞基质材料、其制备方法及应用，以克服现有技术的不足，为实现前述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案包括：本专利技术实施例提供了一种含梯度细胞因子的片状细胞基质材料的制备方法，其包括：构建重组载体，所述重组载体包含细胞因子的编码基因；将所述重组载体整合入宿主细胞，构建能够表达所述细胞因子的重组细胞；将所述重组细胞接种到基体上进行培养，并使在所述基体上培养出的重组细胞的分布密度沿指定方向梯度变化；将附着在基体上的重组细胞冻干，获得含梯度细胞因子的细胞基质材料。进一步的，所述的制备方法具体还可包括：将所述重组载体整合入宿主细胞，构建能够稳定表达所述细胞因子的重组细胞；以抗生素对所述重组细胞进行加药筛选，获得稳转细胞系；以及将所述稳转细胞系接种到基体上进行培养。特别是，在本专利技术的实施例中，可以将所述基体的接种面倾斜放置，从而使接种面上的重组细胞形成密度梯度，进而使重组细胞分泌出的细胞因子(如CBD-SDF-1a)结合在细胞基质材料(特别是其中的1型胶原蛋白)上形成密度梯度。作为优选的方案之一，所述细胞因子为具有胶原结合域的SDF-1α融合蛋白。在一些实施方案中，所述宿主细胞包括人体细胞。本专利技术实施例还提供了由前述方法制备的含梯度细胞因子的细胞基质材料。进一步的，所述细胞基质材料可以被认为是一种既可以富集SDF-1α细胞因子又可以诱导干细胞定向迁移的ECM生物材料。本专利技术实施例还提供了所述含梯度细胞因子的细胞基质材料的用途，例如于制备功能性产品中的用途，所述功能性产品能够在体外模拟体内的炎症因子梯度微环境。与现有技术相比，本专利技术的有益效果包括：(1)本专利技术通过基因技术构建了携带有胶原结合区域CBD的SDF-1α融合基因，进而使其所表达的SDF-1α蛋白结合到细胞基质材料的胶原I上，可以有效达成在细胞基质材料上富集的目的。(2)本专利技术制备的细胞基质材料无需另加生长因子SDF-1α，CBD-SDF-1α的稳转细胞本身就可以往外分泌生长因子SDF-1α的融合蛋白，并可富集在细胞基质材料上。(3)优选的，本专利技术制备的是可富集SDF-1α的片状细胞基质材料(ECM)。(4)本专利技术制备的SDF-1α片状细胞基质材料来源于细胞自身，最小化免疫反应；SDF-1α因子梯度可以在体外模拟体内的炎症微环境，并且可为细胞附着提供支撑，使干细胞向炎症部位迁移(在炎症部位存在SDF-1α因子的浓度梯度)。附图说明图1是本专利技术一实施例中重组载体的构建流程图。图2是本专利技术一实施例中病毒包装流程图。图3A-图3B分别是本专利技术一实施例中稳定表达SDF-1α的稳转细胞系的QPCR、WB验证结果图。图4是本专利技术一实施例中片状ECM材料中含有生长因子SDF-1α蛋白梯度和标志蛋白的WB验证结果图。图5是本专利技术一实施例中片状ECM材料诱导hUCMSC细胞定向迁移的测试图。具体实施方式本专利技术实施例的一个方面提供的一种含梯度细胞因子的细胞基质材料的制备方法包括：构建重组载体，所述重组载体包含细胞因子的编码基因；将所述重组载体整合入宿主细胞，构建能够表达所述细胞因子的重组细胞；将所述重组细胞接种到基体上进行培养，并使在所述基体上培养出的重组细胞的分布密度沿指定方向梯度变化；将附着在基体上的重组细胞冻干，获得含梯度细胞因子的细胞基质材料。进一步的，所述的制备方法具体还可包括：将所述重组载体整合入宿主细胞，构建能够稳定表达所述细胞因子的重组细胞；以抗生素对所述重组细胞进行加药筛选，获得稳转细胞系；以及将所述稳转细胞系接种到基体上进行培养。进一步的，所述细胞因子包括SDF-1α、FGF、EGF、VEGF等各种细胞因子中的任意一种。优选的，所述细胞因子为具有胶原结合域的SDF-1α融合蛋白。优选的，所述编码基因的序列如SEQIDNO:3所示。进一步的，所述的制备方法还可包括：通过病毒包装体系将重组载体整合到宿主细胞基因组中，从而构建形成所述重组细胞。进一步的，所述宿主细胞包括人体细胞，例如人包皮成纤维细胞或间充质干细胞。进一步的，所述含梯度细胞因子的细胞基质材料为片状。本专利技术实施例的一个方面提供了由前述任意一种制备方法制备的含梯度细胞因子的细胞基质材料。本专利技术实施例的一个方面提供了所述含梯度细胞因子的细胞基质材料于制备功能性产品中的用途，所述功能性产品能够在体外模拟体内的炎症因子梯度微环境。本专利技术实施例的一个方面提供了一种生物支架材料，其包含所述含梯度细胞因子的细胞基质材料。本专利技术实施例涉及的一些技术术语的定义如下：细胞外基质(ExtracellularMatrix,ECM)：由细胞合成并分泌到胞外，分布在细胞表面或细胞之间的大分子物质。由三类成分组成：结构蛋白,如胶原等；专一蛋白，如纤维蛋白等；蛋白聚糖。ECM材料是一种良好的生物衍生支架材料，有望成为组织修复重建中替代材料的重要来源。胶原结合域(CollagenBindingDomain,CBD)：一段可以和胶原Ⅰ结合的肽段。基质细胞衍生因子-1(Stromalcell-DerivedFactor1,SDF-1)又称C-X-C基序趋化因子12((C-X-Cmotifchemokineligand12,CXCL12)。基质细胞衍生因子1-α(SDF-1α)和1-β(SDF-1β)是属于趋化因子家族的小细胞因子，CXCL12可以在许多组织(包括脑、胸腺、心、肺、肝、肾、骨髓、脾脏)中表达，对淋巴细胞有强烈的趋化作用并在发育中起重要作用。细胞迁移：细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的浓度梯度后而产生的移动，移动过程中通过胞体形变进行的定向移动本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种含梯度细胞因子的片状细胞基质材料的制备方法，其特征在于包括：构建重组载体，所述重组载体包含细胞因子的编码基因；将所述重组载体整合入宿主细胞，构建能够表达所述细胞因子的重组细胞；将所述重组细胞接种到基体上进行培养，并使在所述基体上培养出的重组细胞的分布密度沿指定方向梯度变化；将附着在基体上的重组细胞冻干，获得含梯度细胞因子的细胞基质材料。

【技术特征摘要】
1.一种含梯度细胞因子的片状细胞基质材料的制备方法，其特征在于包括：构建重组载体，所述重组载体包含细胞因子的编码基因；将所述重组载体整合入宿主细胞，构建能够表达所述细胞因子的重组细胞；将所述重组细胞接种到基体上进行培养，并使在所述基体上培养出的重组细胞的分布密度沿指定方向梯度变化；将附着在基体上的重组细胞冻干，获得含梯度细胞因子的细胞基质材料。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于具体包括：将所述重组载体整合入宿主细胞，构建能够稳定表达所述细胞因子的重组细胞；以抗生素对所述重组细胞进行加药筛选，获得稳转细胞系；以及将所述稳转细胞系接种到基体上进行培养。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述细胞因子包括SDF-1α、FGF、EGF、VEGF中的任意一种；优选的，所述细胞因子为具有胶原结合域的SDF-1...

【专利技术属性】
技术研发人员：索广力，耿俊飒，乔勇，徐中娟，肖同乾，
申请(专利权)人：中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所，
类型：发明
国别省市：江苏,32