用于靶向基因操作的新方法和系统技术方案

本发明专利技术提供用于靶向的然而通用的基因组操作的新方法和系统，其包括细胞系、重组多核苷酸构建体、组合物和试剂盒。

Novel methods and systems for targeting gene manipulation

The present invention provides new methods and systems for general genome manipulation for targeting, comprising cell lines, recombinant polynucleotide constructs, compositions, and kits.

【技术实现步骤摘要】
用于靶向基因操作的新方法和系统对相关申请的交叉参考本申请要求于2015年11月17日提交的美国临时申请号62/256,514的权益，并且要求于2016年1月29日提交的美国临时申请号62/288,974的权益，二者通过引用完全结合在本文中。专利技术背景研发对活细胞的基因组进行精确的靶向改变的有效且可靠的工具是生物医学研究者的长远目标。最近，一种基于来自酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)的细菌CRISPR-相关蛋白-9核酸酶(Cas9)的新技术已经产生了值得注意的兴奋和兴趣，例如，参见，Cong等人(2013)Science，339，819-823。在过去两年间已经进行了多方尝试，以试图利用该CRISPR/Cas9系统以高靶标特异性的方式操作基因组序列和基因功能。另一方面，研究尝试提高CRISPR/Cas9诱导的DNA切割的同源性定向修复(HDR)的效率，用以实现在基因组中的精确的靶向DNA插入：Yu等人在2015年成功地鉴定了几种提高HDR效率的小化学分子[24]；Maruyama等人在2015年抑制了非同源末端连接(NHEJ)途径，从而提高基因组编辑的HDR效率[25]；Zhu等人在2015年开发了iCRISPR系统，从而最优化费力的策略并且避免用于人多能干细胞(hPSC)中的基因敲入的药物选择步骤[26]；Merkle等人在2015年设计了一种策略：利用生物信息学鉴定在靶向的等位基因上物理分离CRISPR靶位点，从而提高基因敲入的精确性[15]。然而，在这些研究中，在介导大DNA片段的敲入方面，特别是在人多能干细胞(hPSCs)中的敲入方面仍然是效率低的。最近，Li等人在2015年和Hisano等人在2015年开发了Cas9-介导的供体载体(donorvector)，其在斑马鱼中表现出高效的DNA插入，并且该系统被证实是可遗传的[27,28]。然而，该系统不是在人细胞中设计并检验的，由此，仍然亟需用于人细胞(包括hPSC)的优化的系统。RNA-指导的基因组改造已经广泛用于细胞生物学研究。原始的CRISPR/Cas9系统表现出市场潜力，并且在最近两年被授予一些美国专利[29-34]。它们中的一些已经处在商业开发阶段。我们之前的专利技术，美国临时专利号62/256,514，提供优化的CRISPR/Cas9系统，其包括灵活的供体载体和有用的步骤，具有成为生物学研究者的用户友好的工具试剂盒产品的重大潜力。另外，本专利技术的潜在的应用包括在临床情形中的多种应用，包括疾病诊断和基因修正。具体而言，本专利技术的Cas9-介导的基因组编辑系统适合用于人细胞并且具有一些优点。例如，这些改进的系统成功地满足了在人细胞(包括人胚胎干细胞(ESCs)和诱导的多能干细胞(iPSCs))中的高HR效率的需要。与之前已知的方法相比，在人ESCs中的HR效率已经提高多至5倍。并且，本专利技术提供通用的基因组编辑系统，其具有也用于低等脊椎动物的潜力。另外，所述系统是用户友好的，包括一些供体构建体的设计，使得这些系统对于研究和临床情境中的多种不同的应用是非常有价值的。在本专利技术中，为Cas9-介导的基因组编辑系统在不同基因组基因座和条件中的应用提供进一步的证据。进一步证明了不依赖同源性的报道子整合的分子基础和效率；并且提供了用于在沉默的基因的基因座处的NHEJ-介导的有效敲入的另外的方法和系统。另外，研究了NHEJ-介导的敲入系统的脱靶效应。并且，公开了向GAPDH基因座的3’-UTR处的CPF1-诱导的DSBs中不依赖同源性敲入报道基因的另外的方法和系统，其证明了对定向整合的偏好性。由此，本申请公开了用于使用CRISPR/CPF1通过NHEJ介导的单向优选的(unidirection-preferred)敲入的方法和系统。本申请还公开了报道基因不依赖同源性的双色插入敲入的另外的方法和系统。因此，本申请公开了用于使用CRISPR/Cas9通过NHEJ介导的双向敲入的方法和系统。另外，公开了在多个基因组等位基因上的一个靶基因中不依赖同源性敲入多种报道基因的方法和系统，这证明产生了单种或两种阳性细胞群体。因此，本申请公开了向多个等位基因中NHEJ-介导敲入多种颜色荧光报道基因的构建体、方法和系统。专利技术概述本专利技术提供用于基于CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1的基因编辑的新的细胞系、多核苷酸构建体、组合物、试剂盒和系统，其允许人们进行关于基因组序列的机制和调节的研究以及鉴定能够调节所述基因组编辑事件的化合物。本文公开的基因编辑系统包括两种一般类型：第一种是涉及两次插入事件的类型，而第二种仅涉及一次插入事件。对于第一种类型，本专利技术提供整合构建体、供体构建体、转化的宿主细胞、组合物、试剂盒以及使用该基因编辑系统的多种方法。更具体而言，在整合构建体中，典型地包括启动子，其从5′到3′可操作地连接用于报道基因的第一非功能性编码片段、中断片段(interruptersegment)和用于报道基因的第二非功能性编码片段，从而使得所述启动子不表达功能性报道蛋白。在一些实施方案中，所述整合构建体还包含两个基因组同源序列，一个位于启动子的5′端，另一个位于用于报道基因的第二非功能性编码片段的3′端。这两个基因组同源序列与细胞预先确定的遗传基因座的基因组序列的两个片段同源，从而使得这两个基因组同源序列的存在允许整合构建体与所述细胞在该预先确定的遗传基因座处的基因组序列之间的同源重组。在一些实施方案中，所述整合构建体是环形构建体，例如，质粒。在一些实施方案中，报道基因编码绿色荧光蛋白(GFP)。在一些实施方案中，两个基因组同源序列中的每一个长度为约100-5000个、200-2500个或500-1500个核苷酸，优选长度为1000个核苷酸。在一些实施方案中，整合构建体中的启动子与报道基因异源(即，取自两个不同的物种或已经被重组修饰过)。在一些实施方案中，用于报道基因的第一和第二非功能性编码片段，当没有中断片段而连接在一起时，编码功能性报道基因蛋白。所述中断片段可以是任意长度的，只要其中断报道基因的表达即可。在一些实施方案中，中断序列长度为约10-2000个、15-1000个、20-500个或25-100个核苷酸，优选长度为30个核苷酸。在一些实施方案中，中断片段包含三个终止密码子，其分别在不同的阅读框中，从而完全消除报道基因的表达。在一些实施方案中，预先确定的遗传基因座包含看家基因。还为第一种类型的基因编辑系统提供供体构建体，其从5′至3′包含第一报道基因同源片段、间隔片段和第二报道基因同源片段。第一和第二报道基因同源片段与整合构建体中用于报道基因的第一和第二非功能性编码片段同源，从而使得这两个报道基因同源片段的存在允许在整合构建体与供体构建体之间的同源重组，从而形成用于功能性报道基因的编码序列。在一些实施方案中，第一和第二报道基因同源片段中的每一个长度为约100-1000个、200-800个或250-500个核苷酸，优选长度为250个、500个或800个核苷酸。在一些实施方案中，间隔片段长度为约10-2000个、15-1000个、20-500个或25-100个核苷酸，例如，长度为30个核苷酸或726个核苷酸。在一些实施方案中，间隔片本文档来自技高网...

【技术保护点】
整合构建体，其包含启动子，所述启动子从5'至3'可操作地与下述连接：报道基因的第一非功能性编码片段，中断片段，和所述报道基因的第二非功能性编码片段，其中从所述启动子不表达功能性报道蛋白。

【技术特征摘要】
2015.11.17 US 62/256,514;2016.01.29 US 62/288,9741.整合构建体，其包含启动子，所述启动子从5'至3'可操作地与下述连接：报道基因的第一非功能性编码片段，中断片段，和所述报道基因的第二非功能性编码片段，其中从所述启动子不表达功能性报道蛋白。2.权利要求1的整合构建体，其还包含两个基因组同源序列，一个位于所述启动子的5'端并且另一个位于所述报道基因的第二非功能性编码片段的3'端，其中这两个基因组同源序列与细胞预先确定的遗传基因座处的基因组序列的两个片段同源，以使这两个基因组同源序列的存在允许在所述整合构建体与所述细胞在所述预先确定的遗传基因座处的基因组序列之间的同源重组。3.权利要求1的整合构建体，其中所述报道基因的第一和第二非功能性编码片段当没有所述中断片段连接在一起时编码功能性报道基因蛋白。4.权利要求2的整合构建体，其中所述预先确定的遗传基因座包含非必需基因。5.供体构建体，其从5'到3'包含：第一报道基因同源片段，间隔片段，和第二报道基因同源片段，其中所述第一和第二报道基因同源片段与权利要求1的报道基因的第一和第二非功能性编码片段同源，以使这两个报道基因同源片段的存在允许在权利要求1的整合构建体与所述供体构建体之间的同源重组，从而形成功能性报道基因的编码序列。6.权利要求5的供体构建体，其中所述间隔片段编码功能性报道基因蛋白。7.包含权利要求1的整合构建体的宿主细胞。8.权利要求7的细胞，其是干细胞或体细胞。9.权利要求7的细胞，其还包含权利要求5的供体构建体。10.用于检测CRISPR-介导的同源性定向修复途径的方法，所述方法包括下述步骤：(i)使权利要求7的细胞与下述接触：权利要求5的供体构建体，编码能够与权利要求1中报道基因的非功能性编码片段或中断片段内部约20个核苷酸的片段杂交的sgRNA的DNA分子，和编码Cas9蛋白的DNA分子；并且(ii)检测由所述报道基因蛋白产生的信号。11.用于鉴定CRISPR-介导的同源性定向修复途径的增强剂的方法，所述方法包括下述步骤：(i)在存在和不存在候选化合物的条件下，使权利要求7的细胞与下述接触：权利要求5的供体构建体，编码能够与权利要求1中报道基因的非功能性编码片段或中断片段内部约20个核苷酸的片段杂交的sgRNA的DNA分子，和编码Cas9蛋白的DNA分子；并且(ii)检测由报道基因蛋白产生的信号；并且(iii)当与不存在所述化合物相比，在存在所述化合物的条件下检测到更高的报道基因蛋白信号时，确定所述化合物为CRISPR-介导的同源性定向修复途径的增强剂。12.供体构建体，其包含：(1)报道基因的编码序列；(2)位于所述报道基因编码序列的5'端的第一基因组同源片段；和(3)位于所述报道基因编码序列的3'端的第二基因组同源片段，其中所述第一和第二基因组同源片段与预先确定的基因组序列同源。13.用于直接检测CRISPR-诱导的同源性定向修复的活性的方法，所述方法包括下述步骤：(i)使细胞与下述接触：权利要求12的供体构建体，编码能够与预先确定的基因组序列的上游或下游非编码序列内部的片段杂交的sgRNA的DNA分子，和编码Cas9蛋白的DNA分子；并且(ii)检测由报道基因蛋白产生的信号。14.用于鉴定CRISPR-诱导的同源性定向修复的增强剂的方法，所述方法包括下述步骤：(i)在存在和不存在候选化合物的条件下，使细胞与下述接触：权利要求12的供体构建体，编码能够与预先确定的基因组序列的上游或下游非编码序列内部的片段杂交的sgRNA的DNA分子，和编码Cas9蛋白的DNA分子；并且(ii)检测由报道基因蛋白产生的信号；并且(iii)当与不存在所述化合物相比，在存在所述化合物的条件下检测到更高的报道基因蛋白信号时，确定所述化合物为CRISPR-诱导的同源性定向修复的增强剂，并且，当与不存在所述化合物相比，在存在所述化合物的条件下检测到更低的报道基因蛋白信号时，确定所述化合物为CRISPR-诱导的同源性定向修复的抑制剂。15.供体构建体，其包含：(1)报道基因编码序列；(2)在所述报道基因编码序列的5'端的双顺反子元件；(3)在所述报道基因编码序列的3'端的多聚腺苷酸片段，(4)任选地具有一个位于所述报道基因编码序列的5'端或所述多聚腺苷酸片段的3'端的sg-A靶序列位点，或具有两个sg-A靶序列位点，一个位于所述报道基因编码序列的5'端，另一个位于所述多聚腺苷酸片段的3'端；和(5)任选地具有插入在所述双顺反子元件的5'端的包含多个终止密码子的序列。16.用于检测CRISPR-诱导的非同源末端连接修复的方法，所述方法包括下述步骤：(i)使细胞与下述接触：权利要求15的供体构建体，编码分别能够与靶序列位点之一杂交的一种或两种sgRNAs的一种或两种DNA分子，和编码Cas9蛋白的DNA分子；并且(ii)检测由报道基因蛋白产生的信号。17.用于鉴定CRISPR-诱导的非同源末端连接修复的增强剂的方法，所述方法包括下述步骤：(i)在存在和不存在候选化合物的条件下，使细胞与下述接触：权利要求15的供体构建体，编码分别能够与靶序列位点之一杂交的一种或两种sgRNAs的一种或两种DNA分子，和编码Cas9蛋白的DNA分子；并且(ii)检测由报道基因蛋白产生的信号；并且(iii)当与不存在所述化合物相比，在存在所述化合物的条件下检测到更高的报道基因蛋白信号时，确定所述化合物为CRISPR-诱导的非同源末端连接修复的增强剂，并且，当与不存在所述化合物相比，在存在所述化合物的条件下检测到更低的报道基因蛋白信号时，确定所述化合物为CRISPR-诱导的非同源末端连接修复的抑制剂。18.用于通过CRISPR-诱导的非同源末端连接修复在活性基因的基因座插入报道基因以产生报道细胞的方法，所述方法包括下述步骤：(i)使细胞与下述接触：权利要求15的供体构建体，编码分别能够与靶序列位点之一杂交的一种或两种sgRNAs的一种或两种DNA分子，和编码Cas9蛋白的DNA分子；(ii)检测由报道基因蛋白产生的信号；并且(iii)收集表现出共存多于两种报道信号的细胞。19.供体构建体，其包含：(1)报道基因编码序列；(2)在所述报道基因编码序列的5'端的双顺反子元件；(3)在所述报道基因的编码序列的3'端的多聚腺苷酸片段；(4)位于所述双顺反子元件的5'端的第一基因组同源片段；和(5)位于所述多聚腺苷酸片段的3'端的第二基因组同源片段，其中所...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯波，何向军，
申请(专利权)人：香港中文大学，
类型：发明
国别省市：中国香港,81