一种高效转染真核细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种高效转染真核细胞的方法，该方法包括以下步骤：（1）受体细胞的培养；（2）转染液的制备：A液：用培养基MEM稀释1~10μg 浓度为10g/L的供体DNA，定量至100μL；B液：将培养基MEM定量至100μL，然后吸取2~15μg的LR加入到MEM中，室温静置15分钟；A/B复合物：将A液滴加入B液，轻轻弹下离心管壁，室温静置20min；（3）转染：将配置好的Ca

【技术实现步骤摘要】
一种高效转染真核细胞的方法
本专利技术属于生物
，尤其涉及一种高效转染真核细胞的方法。
技术介绍
细胞转染的方法主要包括：电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等，理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等。脂质体（lipofectinregeant，LR）试剂是阳离子脂质体N-[1-2，3-Dioleyoxy，Propyl]-n，n，n-TrimethylammoniumChloride（DOTMA）和Dioleoylphotidye-thanolamine（DOPE）的混合物[1：1（w/w）]。它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方便的转染方法之一。用LR进行转染时，首先需优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批LR而言，均先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从1~5μg和孵育时间6小时开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定出转染时间（2~24小时）。因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24小时为宜。细胞种类：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。阳离子脂质体对细胞的毒性相对较高，为了防止其毒性，需要对脂质体与质粒的比例、细胞转染时间等要素准确掌握。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种高效转染真核细胞的方法。本专利技术是这样实现的，一种高效转染真核细胞的方法，该方法包括以下步骤：（1）受体细胞的培养在转染前一天接种待转染细胞，接种密度为2×105/cm2，用含10%胎牛血清的DMEM液，37℃、5%CO2培养，待细胞占50～70%瓶底面积时，用于转染试验；（2）转染液的制备A液：用培养基MEM稀释1~10μg浓度为10g/L的供体DNA，定量至100μL；B液：将培养基MEM定量至100μL，然后吸取2~15μg的LR加入到MEM中，室温静置15分钟；A/B复合物：将A液滴加入B液，轻轻弹下离心管壁，室温静置20min；（3）转染将配置好的Ca2+载体工作液加入培养好的细胞培养液中，摇匀，将所述A/B复合物缓缓加入步骤（1）所述的细胞培养液中，摇匀，37℃温箱置6～24小时，观察转染效率；其中，所述Ca2+载体工作液配置为：MEM、15mmol/LHepes、0.168mg/mlNaHCO3以及5μmol/LA23187。优选地，在步骤（3）中，所述Ca2+载体工作液的配置包括以下步骤：取1mgA23187在室温情况下，用1.9mlDMSO或DMSO/乙醇混合液溶解为1mmol/LA23187浓缩液；将所述A23187浓缩液、MEM、Hepes、NaHCO3比例混合，得到所述Ca2+载体工作液。优选地，在步骤（2）中，所述供体DNA利用去内毒素质粒大提试剂盒提取得到。本专利技术克服现有技术的不足，提供一种高效转染真核细胞的方法。在本专利技术中，A23187（IA）载体是一种移动性离子载体，但它的功能是运输钙离子、镁离子等二价阳离子。钙离子载体A23187通过Ca2+的跨膜转运，能迅速诱导细胞内Ca2+浓度升高，利于细胞吞入摄取，或通过细胞膜脂相收缩时裂开的空隙进入细胞内，Ca2+能促进膜对DNA-脂质体的吸收，Haberland的体外转染实验表明，Ca2+之所以能促进转染是由于形成了磷酸钙微小沉淀，能促进DNA-复合体的运输和从包涵体膜内的释放。相比于现有技术的缺点和不足，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术快速的将质粒转入真核细胞内，减少脂质体对细胞的毒性作用时间，更高效的将目的基因整合入真核细胞基因组中，减少了后期药物筛选作用时间。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例（1）Ca2+载体工作液的制备取1mgIA（A23187）在室温情况下，用1.9mlDMSO或DMSO/乙醇混合液溶解为1mmol/LA23187浓缩液。应用时，用去离子水或细胞培养液（无血清MEM）稀释后使用。室温下，配置Ca2+载体工作液（A23187工作液），MEM+15mmol/LHepes+0.168mg/mlNaHCO3+5μmol/LA23187；（2）供体DNA制备利用去内毒素质粒大提试剂盒提取高浓度质粒（10g/L）。（3）受体细胞的培养一般在转染前一天接种细胞，接种密度为2×105/cm2，用含10%胎牛血清的DMEM液，37℃、5%CO2培养，待细胞占50～70%瓶底面积时，用于转染试验。以六孔板为例，向每孔中加入2mL含1～2×105个细胞培养液，37℃CO2培养至50%～70%汇合时。（4）转染液制备在聚苯乙稀管中制备以下两液，A液：用不含血清培养基（MEM）稀释1~10μgDNA，最终定量至100μL；B液：用MEM稀释2~15μgLR，首先将需要的MEM最终定量至100μL，然后吸取LR小心滴加入MEM中，室温静置15分钟；A/B复合物（转染液）配置，将A液滴加入B液，轻轻弹下离心管壁，室温静置20分钟，如出现沉淀可能因LR或DNA浓度过高所致。（5）转染：在混合液静置期间，室温下，提前5分钟将配置好的Ca2+载体工作液加入培养液中，摇匀，然后把A/B复合物缓缓加入细胞培养液中，摇匀，37℃温箱置6～24小时，可以在显微镜下观察转染效率。本专利技术实施例中，应用未加A23187试剂的脂质体进行转染，转染后12小时的细胞转染率为50%~55%，而利用A123187和脂质体联合作用后转染效率可达到65%~75%。以上所述仅为本专利技术的较佳实施例而已，并不用以限制本专利技术，凡在本专利技术的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本专利技术的保护范围之内。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高效转染真核细胞的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤： （1）受体细胞的培养在转染前一天接种待转染细胞，接种密度为2×10

【技术特征摘要】
1.一种高效转染真核细胞的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：（1）受体细胞的培养在转染前一天接种待转染细胞，接种密度为2×105/cm2，用含10%胎牛血清的DMEM液，37℃、5%CO2培养，待细胞占50～70%瓶底面积时，用于转染试验；（2）转染液的制备A液：用培养基MEM稀释1~10μg浓度为10g/L的供体DNA，定量至100μL；B液：将培养基MEM定量至100μL，然后吸取2~15μg的LR加入到MEM中，室温静置15分钟；A/B复合物：将A液滴加入B液，轻轻弹下离心管壁，室温静置20min；（3）转染将配置好的Ca2+载体工作液加入培养好的细胞培养液中，摇匀，将所述A/B复合物缓缓加入步骤（1）所述的细胞培养液...

【专利技术属性】
技术研发人员：张全伟，贡继尚，赵兴旭，张勇，马友记，
申请(专利权)人：甘肃农业大学，
类型：发明
国别省市：甘肃,62