一种阿魏酸体外抗氧化活性的测定方法技术

本发明专利技术的目的是提供一种对共表达阿魏酸酯酶/木聚糖酶的酶解产物阿魏酸进行体外抗氧化活性的测定方法。利用共表达阿魏酸酯酶A和木聚糖酶的酵母系统(GS115/faeA-xyn11A)所产的共表达酶液水解小麦麸皮获得阿魏酸，从还原力、DPPH自由基和羟基自由基清除率三个方面对该阿魏酸进行体外抗氧化活性的测定。实验结果证明阿魏酸有良好的还原能力和自由基清除能力，该测定方法简单有效、方便快捷，在工业应用中阿魏酸的抗氧化测定方面有一定的潜在价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及从还原力、DPPH自由基和羟基自由基清除率三个方面对共表达阿魏酸酯酶/木聚糖酶的酶解产物阿魏酸进行体外抗氧化活性测定，属于生物工程
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技术介绍
阿魏酸酯酶(EC3.1.1.73)能催化水解植物细胞壁中阿魏酸及其衍生物与多糖之间的酯键，从中释放出阿魏酸。近年来，阿魏酸酯酶被广泛应用于饲料、造纸、食品、纺织、医药、生物能源等领域，因而研究者将阿魏酸酯酶的开发和利用推向了一个崭新的高峰。阿魏酸是含量最为丰富的羟基肉桂酸，为当归、川芎的主要药效成分，并广泛存在于升麻、川芍、木贼和阿魏等中药材中。阿魏酸是一种有效的天然抗氧化剂，安全性极高，已被广泛应用于食品、化妆品和新药研发等领域。现已被大众所熟知的太太口服液、心血康等保健品的有效成分之一就是阿魏酸。此外，阿魏酸还具有抗衰老、抗菌、抗炎、抗病毒、抗血栓、吸收紫外线、提高免疫力、预防和抑制癌症、抑制前列腺增生、预防三高、降低胆固醇、增加骨密度、抗动脉粥样硬化和治疗老年痴呆症等一系列生理活性作用。作为一种抗氧化剂，目前，阿魏酸抗氧化特性的测定正逐渐被许多研究者关注，如通过许多体内实验进行研究，但是这些实验过程较为繁琐，耗时较长，随着生物科学领域的不断扩展，运用生物技术手段结合简单的化学方法进行一些性质的测定工作会更加方便快捷，这将加速生物产品、生物技术等在更多领域内的发展。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种从还原力、DPPH自由基和羟基自由基清除率三个方面对阿魏酸进行体外抗氧化活性的验证方法。本专利技术的技术方案:利用共表达阿魏酸酯酶A和木聚糖酶的酵母系统(GS115/faeA-xynllA)所产的共表达酶液`水解小麦麸皮获得阿魏酸，从还原力、DPPH自由基和羟基自由基清除率三个方面对该阿魏酸进行体外抗氧化活性的验证。共表达阿魏酸酯酶A和木聚糖酶的酵母系统(GS115/faeA_xynllA)已申请专利(专利申请号:201210562444.5)。所述的阿魏酸的生产:以预处理麦麸为底物,称取0.5g于摇瓶中，加入一定量的共表达粗酶液,然后加入一定体积的磷酸盐缓冲液(lmM，pH5.0)至终体积30mL。将反应体系在40°C保温12h获得酶解液，经过大孔树脂分离纯化获得阿魏酸。所述的阿魏酸体外抗氧化活性验证方法:(I)还原力的测定:在具塞试管中加入0.2M PBS缓冲液(ρΗ6.6)，I %铁氰化钾溶液和不同浓度的阿魏酸溶液，于50°C恒温水浴反应20min,立即冷却,加入10%三氯乙酸溶液，4000rpm离心8min，取上清液，加入I %三氯化铁溶液和蒸馏水，振荡混匀，静置5min后，在700nm处测定吸光度值(图1)。以蒸馏水代替阿魏酸溶液作为对照。(2)清除DPPH自由基活性的测定:在具塞试管中加入8 X IO-5M DPPH乙醇溶液，无水乙醇和不同浓度的阿魏酸溶液，混匀，室温避光放置30min，于517nm处分别测定吸光度值K,以无水乙醇代替阿魏酸溶液为对照，测定其值为A。，乙醇代替DPPH的测定值为Ax。。DPPH 自由基清除率(% ) = [A0-(Ax-Axo)]/A0X 100 (图 2)(3)清除羟基自由基活性的测定:在具塞试管中依次加入5mM FeSO4，不同浓度的阿魏酸溶液，IOmM H2O2和IOmM水杨酸，37°C恒温水浴摇床中反应15min，立即冷却，离心后取上清液于510nm分别测定吸光度值Ax，以水杨酸代替阿魏酸溶液为对照，测定其值为A。，水杨酸代替双氧水的测定值为Ax。。羟基自由基清除率(%) = [A0-(Ax-Axo)]/A0X 100 ( 0 2)本专利技术的有益效果:本专利技术提供了一种新型阿魏酸体外抗氧化活性验证的方法，在一定条件下，通过对阿魏酸还原力、DPPH自由基和羟基自由基清除率三个方面的测定，证明阿魏酸有良好的还原能力和自由基清除能力，该方法简单有效、方便快捷，在工业应用中阿魏酸的抗氧化测定方面有一定的潜在价值。【附图说明】图1:阿魏酸的还原力曲线图图2:阿魏酸对DPPH自由基和羟基自由基的清除能力曲线图【具体实施方式】以下结合具体实施 例，进一步阐述本专利技术的操作方法。但是这些实施例仅用于详细说明本专利技术，而不用于限制本专利技术的范围。实施例1阿魏酸的制备以预处理麦麸为底物，称取0.5g于摇瓶中，加入3.72mL共表达粗酶液，然后加入磷酸盐缓冲液(lmM，pH5.0)至终体积30mL。将反应体系在40°C保温12h，收集酶解液，将IOmL麸皮水解液以lmL/min上大孔树脂柱进行动态吸附，待吸附结束静置2h后，用蒸馏水缓慢洗脱，流速为lmL/min，分批收集洗脱液，待水洗液中不再含有还原糖、色素等杂质后，改用50%的乙醇进行洗脱，流速为1.5mL/min，收集洗脱液，置于真空旋转蒸发仪中浓缩至终体积为10mL，并采用HPLC检测其阿魏酸含量为1.75mg。实施例2阿魏酸体外抗氧化活性验证(I)还原力的测定在具塞试管中加入ImL0.2M PBS缓冲液(pH6.6)，2mLl %铁氰化钾溶液和ImL不同浓度的阿魏酸样品溶液，于50°C恒温水浴反应20min，立即冷却，加入1.0mL10%三氯乙酸溶液，4000rpm离心8min，取2mL上清液，加入ImLl %三氯化铁溶液和2.0mL蒸馏水，振荡混匀，静置5min后,在700nm处分别测定吸光度值,结果阿魏酸的还原能力随着浓度的升高而呈现稳定的增长趋势，并呈现出一定的量效关系，20 μ g/mL阿魏酸的还原能力是4 μ g/mL阿魏酸的5.29倍。以蒸馏水代替阿魏酸溶液作为对照。(2)清除DPPH自由基活性的测定在具塞试管中加入3mL8X KT5M DPPH乙醇溶液，ImL无水乙醇和ImL不同浓度的阿魏酸溶液，混匀，室温避光放置30min，于517nm处分别测定吸光度值Ax，以无水乙醇代替阿魏酸溶液为对照，测定其值为A。，乙醇代替DPPH的测定值为Ax。。结果表明阿魏酸的抗氧化能力随着浓度的增高而增强，当阿魏酸浓度为8 μ g/mL时，其自由基清除率为25.3%，而当阿魏酸浓度为16 μ g/mL时，其DPPH.清除率则上升为42.6%。DPPH 自由基清除率(% ) = [A0- (Ax-Axo) ] /A0X 100(3)清除羟基自由基活性的测定在具塞试管中依次加入2mL5mM FeSO4, ImL不同浓度的阿魏酸溶液，ImLlOmMH2O2和ImLlOmM水杨酸,37?恒温水浴摇床中反应15min,立即冷却，离心后取上清液于510nm分别测定吸光度值Ax，以水杨酸代替阿魏酸溶液为对照，测定其值为A。，水杨酸代替双氧水的测定值为Ax。。结果表明，低浓度的阿魏酸就表现出良好的羟基自由基清除率，并随着阿魏酸浓度的增加，相应的羟基自由基清除能力也呈现出稳定的增长趋势。当阿魏酸浓度为20 μ g/mL时，其羟基自由基清除率达到92%。 羟基自由基清除率(％) = [A0-(Ax-Axo) !/A0XlOOo本文档来自技高网...

【技术保护点】
阿魏酸的生产方法：以预处理麦麸为底物，称取0.5g于摇瓶中，加入3.72mL共表达粗酶液，然后加入磷酸盐缓冲液(1mM，pH5.0)至终体积30mL，将反应体系在40℃保温12h，收集酶解液，将10mL麸皮水解液以1mL/min上大孔树脂柱进行动态吸附，待吸附结束静置2h后，用蒸馏水缓慢洗脱，流速为1mL/min，分批收集洗脱液，待水洗液中不再含有还原糖、色素等杂质后，改用50％的乙醇进行洗脱，流速为1.5mL/min，收集洗脱液，置于真空旋转蒸发仪中浓缩至终体积为10mL。

【技术特征摘要】
1.阿魏酸的生产方法: 以预处理麦麸为底物，称取0.5g于摇瓶中，加入3.72mL共表达粗酶液，然后加入磷酸盐缓冲液(lmM，pH5.0)至终体积30mL，将反应体系在40°C保温12h，收集酶解液，将IOmL麸皮水解液以lmL/min上大孔树脂柱进行动态吸附，待吸附结束静置2h后，用蒸馏水缓慢洗脱，流速为lmL/min，分批收集洗脱液，待水洗液中不再含有还原糖、色素等杂质后，改用50%的乙醇进行洗脱，流速为1.5mL/min，收集洗脱液，置于真空旋转蒸发仪中浓缩至终体积为10mL。2.阿魏酸体外抗氧化活性验证: (1)还原力的测定:在具塞试管中加入ImL0.2M PBS缓冲液(pH6.6)，2mLl %铁氰化钾溶液和ImL不同浓度的阿魏酸样品溶液，于50 V恒温水浴反应20min，立即冷却，加入.1.0mLlO %三氯乙酸溶液，4000rpm离心8min,取2mL上清液,加入ImLl %三氯化铁溶液和.2.0mL蒸懼水,振荡混匀,静置5min后,在700nm处分别测定吸光度值,结果阿魏酸的还原能力随着浓度的升高而呈现稳定的增长趋势，并呈现出一定的量效关系，20 μ g/mL阿魏酸的还原能力是4 μ g/mL阿魏酸的5.29倍，以蒸馏水代替阿魏酸溶液作为对照； (2)清除DPPH自由基活性的...

【专利技术属性】
技术研发人员：邬敏辰，殷欣，张鹏，龚燕燕，李剑芳，庞庆丰，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：