一种双酶法从小麦麸皮中制备阿魏酸的方法技术

本发明专利技术提供了一种双酶法从小麦麸皮中制备阿魏酸的方法。利用来源于本实验室的重组阿魏酸酯酶(reAorFaeA)和重组木聚糖酶(reAoXynllA)协同作用对小麦麸皮进行酶解，释放阿魏酸，得到阿魏酸粗提液。采用HPD-300弱极性大孔树脂对阿魏酸粗提液进行纯化，将纯化得到的含有阿魏酸的馏分进行真空干燥得到阿魏酸产品。采用本发明专利技术提取制备阿魏酸原料廉价易得，产物纯度较高，制备工艺简单，操作简便易行，环境友好，适用于工业化放大生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种利用生物酶从小麦麸皮中制备阿魏酸的方法，属于生物工程
。
技术介绍
我国是农业生产大国，每年麦麸、玉米芯、米糠等农副产品细胞壁物质产量约为3000万吨，多被丢弃或用作动物饲料，综合利用率低，且经济价值不高。阿魏酸(ferulicacid)的化学名称为4-羟基-3-甲氧基肉桂酸，是桂皮酸的衍生物之一，在麦麸、米糠、蔗渣等谷物中含量较高，它是一种天然的抗氧化剂，具有抑制血小板聚集，促进血小板溶解，抗血栓的形成，抗氧化，抗肿瘤等生理作用，在医药及食品等行业受到重视。从小麦麸皮中提取制备阿魏酸既可以延长小麦产业链条，提高小麦的附加值，同时又可以得到有药用价值和保健功能的游离阿魏酸，其经济意义、社会意义巨大。 目前阿魏酸的生产方法主要包括化学合成和碱解法，但这两种方法均存在一定的缺陷。化学合成法反应步骤多、周期长；碱解法的原料谷维素在米糠中含量低，产量受限；此外，这两种方法都具有污染性，因此酶法生产阿魏酸具有较大优势。阿魏酸酯酶作为羧酸酯水解酶的一个亚类，可以水解植物细胞壁中多糖与阿魏酸连接的酯键，并释放出游离的阿魏酸单体或二聚体。单一使用阿魏酸酯酶，酶与纤维素酯键不能充分反应，导致水解率低。如果采用阿魏酸酯酶和多糖水解酶共同作用于细胞壁，同时打断阿魏酸酯键和糖苷键，无疑将使低聚糖的水解产率得到提高，同时又可生产阿魏酸。然而，酶解液是一个复杂的体系，从中分离出阿魏酸仍比较困难。寻找合适的阿魏酸的纯化工艺也是实现阿魏酸工业化生产所需要突破的一个瓶颈。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供一种从小麦麸皮中提取制备阿魏酸，并且环保安全，周期短，操作简单的工艺，为阿魏酸的酶法生产奠定理论基础。本专利技术的技术方案:利用重组阿魏酸酯酶(reAorFaeA)和重组木聚糖酶(reAoXynllA)双酶法水解小麦麸皮，得到阿魏酸粗提液，经HPD-300大孔树脂纯化制备高纯度的阿魏酸产品。所涉及到的具有重组阿魏酸酯酶(reAorFaeA)和重组木聚糖酶(reAoXynllA)活性的工程菌株 GS115/AorfaeA(专利申请号:201210562540.X)和 GS115/AoxynllA(AnnMicrobiol,2013,63:1109-1120)由本实验室构建保存。所述的阿魏酸的分析测定方法:高效液相(HPLC)分析阿魏酸的释放量。具体操作为:准确称取5mg反式阿魏酸标准品，加入适量乙醇溶解后定容至50mL，即得0.lmg/mL的反式阿魏酸标准溶液。用缓冲液将阿魏酸标准溶液稀释成不同浓度，用高效液相色谱法(HPLC)测定峰面积。以阿魏酸含量为横坐标，相应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。将样品过膜(0.45μπι)后进行HPLC分析。色谱条件:戴安UltiMate-3000高效液相色谱仪，ZW&A-C18反相色谱柱，紫外检测器，检测波长320nm，柱温为30°C，流动相为甲醇和I %乙酸二步梯度洗脱(O-1Omin内甲醇浓度由20 %上升为50 %，10-20min内甲醇浓度由50 %上升为80 % )，流速为lmL/min，进样量为20 μ L0根据标准曲线计算阿魏酸含量。所述的双酶法提取小麦麸皮中的阿魏酸:(I)称取50g小麦麸皮，向其中加入适量0.3% (w/v)的醋酸钾溶液，于95°C浸泡30min后，用大量蒸馏水反复冲洗，并在105°C烘干至恒重，粉碎，过60目筛备用。(2)准确称取0.5g去淀粉麸皮于IOOmL锥形瓶中，加入8mL reAorFaeA酶液(约16.88U)和 0.5mL reAorXynllA 酶液(约 72.5515U)，用 0.lmmol/L、pH5.0 的磷酸盐缓冲液定容至30mL，于40°C酶解10h，煮沸5min灭酶活，离心收集上清液即为阿魏酸粗提液。粗提液经旋转蒸发浓缩到ImL后真空干燥，得到阿魏酸粗提产品，HPLC法分析阿魏酸的含量。所述的大孔树脂纯化阿魏酸粗提液:(I)将阿魏酸粗提液浓缩至阿魏酸质量浓度为0.lmg/mL，浓缩液调pH至4.0，选用HPD-300型大孔树脂，室温下，树脂装填量为20mL。将处理好的阿魏酸粗提液IOOmL以lmL/min上柱动态吸附后，静置2h，水洗柱子至流出液为无色，用100mL50%乙醇以lmL/min的流速洗脱，定量收集。(2)收集到的馏分经旋转蒸发浓缩到ImL后真空干燥，得到阿魏酸产品，HPLC法分析阿魏酸的含量(图1)。本专利技术的有益效果:本专利技术提供了一种从农业废弃物小麦麸皮中提取制备阿魏酸的方法。实现了双酶法协同作用水解小麦麸皮提取阿魏酸，避免了以往碱法制备阿魏酸的种种弊端，同时利用大孔型弱极性吸附树脂和在合适浓度的低级醇条件下能够洗脱出阿魏酸的原理，对所产阿魏酸进行了进一步的吸附分离，有效的富集了阿魏酸，成本低，周期短，无污染。为进一步工业化绿色生产阿`魏酸奠定了基础。【附图说明】图1:阿魏酸产品的HPLC检测图谱【具体实施方式】以下结合具体实施例，进一步阐述本专利技术的操作方法。但是这些实施例仅用于详细说明本专利技术，而不用于限制本专利技术的范围。实施例1双酶法提取小麦麸皮中的阿魏酸准确称取0.5g小麦麸皮,置于IOOmL锥形瓶中。加入8mL reAorFaeA酶液(约16.88U)和 0.5mL reAorXynllA 酶液(约 72.5515U)，用 0.lmmol/L、pH5.0 的磷酸盐缓冲液定容至30mL，于40°C酶解10h，煮沸5min灭酶活，离心收集上清液为阿魏酸粗提液，粗提液经旋转蒸发浓缩至lmL，真空干燥得到阿魏酸粗提粉末，称重为1.75g，经HPLC检测，阿魏酸含量为0.13%。[0021 ] 实施例2大孔树脂纯化阿魏酸粗提液将阿魏酸粗提液浓缩至阿魏酸质量浓度为0.lmg/mL，浓缩液调pH至4.0,选用HPD-300型大孔树脂，树脂湿法装柱20mL，将处理好的阿魏酸粗提液IOOmL以lmL/min上柱动态吸附后，静置2h，水洗柱子至流出液为无色，用100mL50%乙醇以lmL/min的流速洗脱，洗脱液经旋转蒸发浓缩至lmL，真空干燥成粉末，称重为431mg，经HPLC检测，阿魏酸含量为22.5%，回收 率为97%。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从小麦麸皮中制备阿魏酸的方法，其特征在于以小麦麸皮为原料以阿魏酸酯酶和木聚糖酶双酶法协同作用提取阿魏酸：(1)预处理：称取50g小麦麸皮，向其中加入适量0.3％(w/v)的醋酸钾溶液，于95℃浸泡30min后，用大量蒸馏水反复冲洗，并在105℃烘干至恒重，粉碎，过60目筛备用；(2)酶处理：准确称取0.5g去淀粉麸皮于100mL锥形瓶中，加入8mL?reAorFaeA酶液(约16.9U)和0.5mL?reAorXynllA酶液(约72.6U)，用0.1mmol/L、pH5.0的磷酸盐缓冲液定容至30mL，于40℃酶解10h，煮沸5min灭酶活，离心收集上清液即为阿魏酸粗提液。

【技术特征摘要】
1.一种从小麦麸皮中制备阿魏酸的方法，其特征在于以小麦麸皮为原料以阿魏酸酯酶和木聚糖酶双酶法协同作用提取阿魏酸: (1)预处理:称取50g小麦麸皮，向其中加入适量0.3% (w/v)的醋酸钾溶液，于95°C浸泡30min后，用大量蒸馏水反复冲洗，并在105°C烘干至恒重，粉碎，过60目筛备用； (2)酶处理:准确称取0.5g去淀粉麸皮于IOOmL锥形瓶中，加入8mL reAorFaeA酶液(约 16.9U)和 0.5mL reAorXynllA 酶液(约 72.6U)，用 0.lmmol/L、pH5.0 的磷酸盐缓冲液定容至30mL，于40°C酶解10h，煮沸5min灭酶活，离...

【专利技术属性】
技术研发人员：邬敏辰，曾妍，王春娟，殷欣，李剑芳，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：