用经修饰的微生物改善乙醇酸发酵产生制造技术

本发明专利技术涉及用于一种用于发酵产生乙醇酸，其衍生物或前体的方法，其包括在包含碳源的合适培养基中培养大肠杆菌菌株，并回收培养基中的乙醇酸，其中所述大肠杆菌菌株经过修饰以改善乳清酸至乳清苷5’-P的转化。本发明专利技术亦涉及经修饰的大肠杆菌菌株，其显示改善的乳清酸至乳清苷5’磷酸的转化，且任选地进一步经修饰以供改善的乙醇酸产生。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用经修饰的微生物改善乙醇酸发酵产生专利技术目的本专利技术涉及用于从廉价的碳底物如葡萄糖或其它糖生物产生乙醇酸的改善的方法。本专利技术涉及修饰大肠杆菌K-12基因组DNA，使得所述微生物包含增加的乳清酸磷酸核糖基转移酶(orotate phosphoribosyl transferase,OPRTase)活性，其目的是减少副产物乳清酸的产生和优化乙醇酸合成。
技术介绍
乙醇酸(H0CH2C00H)(glycolic acid 或 glycolate),是羧酸的 α -轻基酸家族中最简单的成员。乙醇酸在非常小的分子上具有双官能性，即具有醇和中等强酸官能团。其性质使其非常适于广泛的消费和工业应用，包括用于水井再生(water wellrehabilitation),皮革工业，油气工业(oil and gas industry),洗漆和纺织品工业，以及作为个人护理产品的成分。乙醇酸亦可用于产生多种聚合材料，包括含聚乙醇酸的热塑性树脂。包含聚乙醇酸的树脂具有良好的阻气性质(gas barrier property),且此类包含聚乙醇酸的热塑性树脂可用于制备具有相同性质的包装材料(例如饮料容器等)。聚酯聚合物在水性环境中以可控制的速率逐渐水解。该性质使其可用于生物医学应用如可溶解的缝线，以及用于其中需要酸的受控释放以减少PH的应用中。目前，在美国每年消费超过15，000吨的乙醇酸。尽管乙醇酸作为痕量成分天然见于甘蔗、甜菜、葡萄和水果，但其主要是合成产生的。用于产生乙醇酸的其它技术描述于文献或专利申请中。例如，Mitsui Chemincals, Inc.描述了一种通过使用微生物从在末端具有羟基的脂族多元醇产生所述羟基羧酸的方法(EP2025759A1和EP2025760A1)。该方法是如Michihiko Kataoka在其关于使用乙二醇氧化微生物产生乙醇酸的论文中 所述的生物转化(Biosc1.Biotechnol.Biochem., 2001)。乙醇酸亦使用具有改善的腈水解酶活性的突变体腈水解酶从乙醇腈通过生物转化产生，且该技术由Dupont de Nemours and Co在W02006/069110中公开。用于通过发酵从可再生资源使用其它细菌菌株产生乙醇酸的方法公开于来自Metabolic Explorer的专利申请(W02007/141316 和 US61/162, 712 和 EP09155971.6，其申请日为 2009 年 3 月 24 日)。出于构建用于产生乙醇酸的更佳菌株的目的，本专利技术的专利技术人一直对一些特定大肠杆囷囷株感兴趣。大肠杆菌为工业生物技术中使用的第一种生产微生物，且仍旧为最常用的一种。由于对大肠杆菌K-12菌株的多年研究，该菌株内的各种克隆对于操纵重组DNA和产生大量化学品是特别有吸引力的宿主。当前，用于研究和商业目的的大肠杆菌K-12菌株是在对该菌株的最早研究中构建和分离的克隆通过使用X射线辐照，之后用UV辐照以诱导随机突变所产生的衍生物(Bachmann, B.J.1987.Derivations and genotypes ofsome mutant derivatives of E.coli K-12, p.1191-1219.于 J.L.1ngraham, Κ.B.Low, B.Magasanik, M.Schaechter 和 Η.E.Humbarger(编),Escherichia coli and Salmonellatyphimurium: cellular and molecular biology)。一些突变体或衍生物已经经有目的的选择而演化，并因此具有充分表征的突变。然而，亦认识到许多当前的衍生物含有未检测的和/或，尚未表征的等位基因差异。因此，大肠杆菌K-12菌株的成员彼此通过在一个或多个基因中的点突变而不同。许多大肠杆菌K-12菌株在rph基因中具有移码突变(Jensen K.F.1993，J.Bacteriol.175:3401-3707)。该点突变导致在最后15个密码子的翻译中的移码，并使得rph基因产物的大小减少了 10个氨基酸残基。该截短的蛋白缺乏核糖核酸酶PH活性，且在rph顺反子中的提前翻译终止解释了大肠杆菌K-12中乳清酸磷酸核糖基转移酶的低水平，因为需要转录和翻译的紧密偶联以支持越过顺反子间PryE减弱子的转录的最优水平。已显示该点突变影响下游pyrE基因的表达，该基因编码乳清酸磷酸核糖基转移酶(ORPTase),其催化乳清酸至乳清苷5’磷酸的转化(Poulsen P等1984, EMB03:1783-1790) ο由于pyrE基因的表达减少，ORPTase的减少水平导致底物乳清酸在细胞生长过程中在细胞中和生长培养基中的蓄积(Womack J.E.和O’ DonavanG.A.1978，J.Bacteriol, 136:825-827)。而且，专利US593243描述了在含有移码突变的大肠杆菌K-12菌株中野生型rph基因的回复增加了此类菌株中产生的异源蛋白的量。乳清酸是不希望的，因为其代表碳的消耗，而该碳本可用于生成生物质或乙醇酸。而且，乳清酸是在乙醇酸纯化过程中难以消除的副产物，并因此增加纯化成本。此外，痕量乳清酸可使得终产物着色。本专利技术解决的问题是减少从廉价的碳底物如葡萄糖或其它糖生物产生乙醇酸过程中的乳清酸蓄积。成本的减少可为显著的，因为乙醇酸产生属性得到改善。
技术实现思路
本专利技术涉及用于改善由大肠杆菌菌株进行的乙醇酸的发酵产生的工艺，其中所述菌株经修饰以改善乳清酸至乳清苷5’磷酸的转化。所述转化的增加对乙醇酸的产生具有改善作用。用于发酵产生乙醇酸，其衍生物或前体的方法包括在包含碳源的合适培养基中培养大肠杆菌菌株，并回收培养基中的乙醇酸，其中所述菌株经修饰以改善乳清酸至乳清苷5’磷酸的转化。在本专利技术的第一个实施方案中，在经修饰的菌株中增加乳清酸磷酸核糖基转移酶(OPRTase)比活性。在本专利技术的另一个实施方案中，修饰所述大肠杆菌菌株以增强磷酸核糖基焦磷酸(PRPP)，一种将乳清酸转化为乳清苷5’磷酸的反应的必需辅因子的产生。这两种修饰，OPRTase活性的增加和PRPP产生的增加，都可导入同一大肠杆菌菌株。在本专利技术的一个优选实施方案中，该菌株进一步经遗传工程改造以增强乙醇酸的产生。本专利技术亦涉及用于制备乙醇酸的方法，其中将根据本专利技术的微生物在包含碳源的合适生长培养基中生长，并回收乙醇酸。 本专利技术亦涉及经修饰的大肠杆菌菌株，其呈现如上所述的修饰。附图说明图1:涉及酶PyrE (乳清酸磷酸核糖基转移酶)和PrsA (PRPP合成酶)的嘧啶生物合成和戊糖磷酸途径。图2:显示三种不同生物合成途径:乙醇酸、戊糖磷酸和嘧啶途径的联系的示意图。图3:质粒 pBBRlMCS5-Ptrc04/RBS01*5-pyrE-TTs 的图谱。图 4:质粒 pBBRlMCS5-Ptrc04/RBS01*5-pyrE-prsA-TTs 的图谱。专利技术详述 本专利技术涉及用于发酵产生乙醇酸，其衍生物或前体的新方法，其包括在包含碳源的合适培养基中培养大肠杆菌菌株，并回收培养基中的乙醇酸，其中所述大肠杆菌菌株经修饰以改善乳清酸至乳清苷5’磷酸的转化。在本专利技术的一个优选实施方案中，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：W迪斯切特，C科洛姆，G贝斯特尔科雷尔，
申请(专利权)人：代谢探索者公司，
类型：
国别省市：