VBNC状态啤酒易感乳酸菌的诱导及复苏方法技术

本发明专利技术属于食品微生物培养和检测领域，涉及两种诱导啤酒易感乳酸菌进入“活的但不可培养”（viable?but?non-culturable，VBNC）状态的方法以及将该VBNC状态下易感乳酸菌复苏至正常状态的方法和应用。其中两种诱导方法分别为，一是通过0～4℃低温储藏；二是通过啤酒环境下连续传代驯化培养，这两种方法均可获得处于VBNC状态下的啤酒易感乳酸菌。另外，本发明专利技术还包括一种通过添加过氧化氢酶促进VBNC细菌生长的复苏方法。VBNC状态啤酒易感乳酸菌的诱导及复苏研究对找到逃避检测的“隐形”污染源，提高啤酒检测结果的准确性和检测效率具有十分重要的意义，并为啤酒易感乳酸菌的预防监控奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术属于食品微生物培养和检测领域，涉及两种诱导啤酒易感乳酸菌进入“活的但不可培养”（viable?but?non-culturable，VBNC）状态的方法以及将该VBNC状态下易感乳酸菌复苏至正常状态的方法和应用。其中两种诱导方法分别为，一是通过0～4℃低温储藏；二是通过啤酒环境下连续传代驯化培养，这两种方法均可获得处于VBNC状态下的啤酒易感乳酸菌。另外，本专利技术还包括一种通过添加过氧化氢酶促进VBNC细菌生长的复苏方法。VBNC状态啤酒易感乳酸菌的诱导及复苏研究对找到逃避检测的“隐形”污染源，提高啤酒检测结果的准确性和检测效率具有十分重要的意义，并为啤酒易感乳酸菌的预防监控奠定基础。【专利说明】VBNC状态啤酒易感乳酸菌的诱导及复苏方法
本专利技术涉及啤酒易感乳酸菌“活的但不可培养”(VBNC)状态的两种诱导方法以及一种VBNC状态易感乳酸菌的复苏方法和应用，属于食品微生物培养和检测领域。
技术介绍
据国家统计局公布的最新数据显示，2012年我国啤酒产量累计达4902万千升，同比增长3.1%，与此同时我国啤酒的生产品种也向多样化、个性化方向发展，产品质量稳步提高，企业规模不断扩大，啤酒工业整体装备水平日新月异。我国的啤酒工业已发展成为一个具有现代化规模的工业体系，在国民经济中占有举足轻重的地位。虽然啤酒业近几十年来的发展势头良好，但是污染啤酒的微生物依然是困扰国内外各大啤酒酿造企业的一大难题。同时消费者评价啤酒质量的标准是口味新鲜、酒体澄清、泡沫丰富以及色度适中，这就决定了啤酒发酵需要纯种发酵，这样才能满足口味纯正、风味稳定的要求。所以国内和世界各大啤酒生产企业都对微生物污染的控制特别严格。啤酒长期以来一直被公认为安全性食品，原因在于其特定的理化性质，含有一定浓度的酒精(0.5~10%，w/w)、极低含量的氧(〈0.lppm)、高浓度的二氧化碳(大约0.5%，w/W)、较低pH (3.8~4.7)且存在具有抗菌特性的酒花苦味物质，缺乏微生物生长和繁殖所需要的营养(如单糖和氨基酸等)。因此，啤酒具有一定的抑菌作用，能够抵抗一般微生物的侵袭，并能防止人体致病菌的出现。尽管如此，在啤酒厂的环境中，仍然有一些耐酸、耐酒花苦味物质和专性厌氧的微生物，它们利用酵母的中间代谢产物和酵母自溶物，给啤酒生产带来危害。我国虽然多年来连续保持“世界啤酒第一产销大国”的地位，但是与国外先进水平相比还有较大的差距，特别是在啤酒酿造中易感乳酸菌的检测技术与研究方面。啤酒易感乳酸菌亦称为啤酒有害微生物，是指其代谢产物能够对啤酒的风味和口感产生损害，或者通过形成混浊、沉淀等使啤酒外观发生变化的微生物的总称。传统的平板培养法一直是国内外大多数啤酒厂检测污染微生物的常规方法，但对于某些啤酒易感乳酸菌尤其是难培养菌使用该法一般需要十天甚至更长的时间，其结果严重滞后于生产，无法满足对啤酒生产过程污染菌的控制需求。06年Suzuki等发现,两种啤酒易感乳酸菌LactobacillusIindneri和L.paracolIinoides可通过形成VBNC状态以适应啤酒环境,使用常规的平板培养法难以检测出，但对于啤酒同样具有污染能力(Suzuki, K.，Iijima, K.，Asano, S.，Kuriyama, H., and Kitagawa, Y.1nduction of viable but nonculturable state in beerspoilage lactic acid bacteria, J.1nst.Brew.，2006，112，295-301)。VBNC 状态指可培养的不能产生孢子的细菌遇到环境压力后，在琼脂培养基上形成的菌落数不断下降直至完全消失，但此期间细胞总数基本恒定，这些细胞仍然是“活”的，条件适宜后能够再次回到可培养状态。此状态下的细菌仍具有细胞的完整性，并保持低水平的呼吸作用及代谢活性。为了更好地监控啤酒生产的卫生状况特别是纯生啤酒的纯净化酿造，迫切需要建立更加快速、高效、准确度高的微生物检测鉴定体系。通过对啤酒易感乳酸菌特别是难培养菌VBNC状态的研究，可以找到逃避检测的“隐形”污染源，提高啤酒检测结果的准确性和检测效率，为啤酒易感乳酸菌的预防监控奠定基础。
技术实现思路
为了更好地还原啤酒易感乳酸菌在啤酒酿造环境中的实际生存状态，并解决活的但不可培养(VBNC)状态乳酸菌复苏生长的问题，本专利技术的目的在于提供两种诱导啤酒易感乳酸菌进入VBNC状态的方法。本专利技术的另一目的在于提供一种将上述处于VBNC状态的易感乳酸菌复苏至正常状态的方法。本专利技术的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。依据本专利技术提出的一种VBNC状态啤酒易感乳酸菌的诱导方法，其可以通过低温储藏法或啤酒内连续传代驯化法分别获得处于VBNC状态下的耐乙酸乳杆菌(L.acetotolerans)2011-8,该诱导方法包括如下步骤:I)原始菌株的培养L.acetotolerans2011-8采用MRS固体培养基进行纯化复壮，挑取固体平板上较大的菌落接种于液体MRS培养基中，25-28°C厌氧培养3_5天；2) VBNC状态菌的诱导(以下两种工艺可以任选其一)a.低温储藏取L.acetotolerans2011-8培养物放入0-4°C冰箱内保存,并且每隔7天进行一次MRS平板计数，本试验重复三次且设定正常培养下的L.acetotolerans2011-8为对照组，直至平板25-28°C厌氧培养14天无单菌落出现；b.啤酒内连续传代以步骤I)中的 L.acetotolerans2011_8 的培养物(约 I X 107cfu/mL)作为第 0 代，取ImL的0#培养物接种于IOmL灭菌后的脱气啤酒中，25_28°C厌氧培养6天至出现絮状沉淀，即作为第I代(1#)。再取ImL的1#培养物接种于IOmL灭菌后的脱气啤酒中，25-28°C厌氧培养6天，另外吸取0.1mL的1#培养物涂布于MRS固体平板上进行细菌计数，重复上述操作直至计数平板25-28°C厌氧培养14天无单菌落出现。3 ) VBNC状态菌的检测首先选用吖啶橙荧光显微镜计数法(AODC)直接计数测定细菌总数，具体操作方法如下:将新鲜培养的菌液进行10倍系列稀释，取适当浓度的稀释液加终浓度2%的甲醛固定，再取ImL固定后的稀释液加100 u L0.1%的吖啶橙溶液染色5min，再将0.22 y m黑色微孔滤膜(美国Millipore公司)置于无自发荧光的载玻片上，取适量样品滴于滤膜上，待菌液略干盖上载玻片并压紧，在载玻片上滴一滴无自发突光的香柏油，用突光显微镜(日本Olympus BH-2)于暗室中观察并计数。激发光滤光片为480nm,突光滤光片为510nm。最后根据所取菌液的量和测得的细菌个数换算出菌液的细菌浓度。细菌活性检测米用由Molecular Probes公司生产的LIVE/DEAD@BacLight?Bacterial Viability试剂盒。该试剂盒由两种专染核酸染料组成:一种是绿色突光染料SYT0-9,能渗入完整细胞膜结构的菌体内；一种是红色染料PI，仅能渗到细胞膜破损的菌体内，并且与SYT0-9竞争核酸着染位点。经此试剂盒染色后本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种VBNC状态啤酒易感乳酸菌的诱导方法，其特征在于：该诱导方法包括如下步骤：1）原始菌株的培养将啤酒易感乳酸菌采用MRS固体培养基进行纯化复壮，挑取固体平板上较大的菌落接种于液体MRS培养基中培养；2）采用低温储藏工艺进行VBNC状态菌的诱导取耐乙酸乳杆菌（Lactobacillus?acetotolerans）2011?8培养物放入冰箱内保存，并且每隔7天进行一次MRS平板计数，本试验重复三次且设定正常培养下的L.acetotolerans2011?8为对照组，直至平板25?28℃厌氧培养14天无单菌落出现，此时可认为该菌不可培养，下同；3）VBNC状态菌的检测，该检测方法包括以下步骤：a）首先测定细菌总数将新鲜培养的菌液进行10倍系列稀释，取适当浓度的稀释液加终浓度2%的甲醛固定，再取1mL固定后的稀释液加吖啶橙溶液染色，再将黑色微孔滤膜置于无自发荧光的载玻片上，取适量样品滴于滤膜上，待菌液略干盖上载玻片并压紧，在载玻片上滴一滴无自发荧光的香柏油，用荧光显微镜于暗室中观察并计数；b）采用试剂盒检测细菌活性取1mL计数平板上无单菌落存在的培养物于7000g离心5min，用无菌生理盐水洗涤两次，尽可能地除去细菌培养液，以免培养基产生自发光而干扰观察结果；再加入50μL的无菌蒸馏水重悬菌体沉淀，加入各25μL的绿色染料和红色染料，吹吸混匀后避光染色15?20min；取适量样品滴于无自发荧光的载玻片上，盖上载玻片，并在载玻片上滴1滴无自发荧光的香柏油，用荧光显微镜于暗室中观察并计数。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：邓阳，李惠萍，李琳，房慧婧，涂京霞，陈江，
申请(专利权)人：广州南沙珠江啤酒有限公司，广西珠江啤酒有限公司，
类型：发明
国别省市：