一种利用胎盘小叶组织制备亚全能干细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种从胎盘小叶组织中提取亚全能干细胞的方法，特点是包括胎盘预处理后，利用胎盘小叶组织制备细胞悬液，再利用细胞悬液制备得到亚全能干细胞分离液的步骤；然后将亚全能干细胞分离液进行原代培养和二代培养，收集二代培养过程中完全脱落细胞即得到亚全能干细胞的步骤；最后进行程序降温冻存，将温度降至-80～-90.0℃后取出冻存样本，放入液氮储存罐长期保存即可，优点是传代能力可达20代，不仅具有向成骨、软骨、脂肪和神经细胞分化的能力，还具有向胰岛细胞和表皮细胞分化的能力，亚全能干细胞均一、稳定、生长周期短，操作简单，成本低。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种利用胎盘小叶组织制备亚全能干细胞的方法，其特征在于包括以下步骤：??（1）亚全能干细胞分离???A.细胞悬液制备：将胎盘预处理后获取胎盘小叶组织，将胎盘小叶组织剪成0.5～1.5mm3小块，置于无菌离心管内并加入生理盐水混匀后，加入与胎盘组织等体积的浓度为1～1.5mg/ml的Ⅱ型胶原蛋白酶充分混匀，于37℃消化0.5～2小时后，吸取离心管内上清液，将原离心管内的沉淀用生理盐水混匀，瞬间离心并吸取上清液，重复离心操作两次，合并上述各上清液并用200目无菌滤网过滤，收集细胞初悬液；将细胞初悬液于1000～2000rpm的转速下离心5～20分钟，取离心得到的沉淀加入生理盐水定容，得到的细胞悬液；B.亚全能干细胞分离液的制备：将细胞悬液按体积比1～2:1的比例缓慢加入到淋巴细胞分离液中，于500～1000rpm离心5～20min后，离心管内混合液自下到上依次分层为红细胞层、淋巴细胞分离液层、单个核细胞层和生理盐水层，吸取单个核细胞层至另一离心管内，加入1.5倍细胞悬液体积的生理盐水混匀，于1000～2000rpm离心5～20分钟后，将离心所得的沉淀用0.5倍细胞悬液体积的含10%胎牛血清的培养液混匀沉淀，得到亚全能干细胞分离液；???（2）亚全能干细胞培养????将亚全能干细胞分离液以2×105～10×105个/cm2的密度接种到无菌培养瓶内，并加入培养液，然后置于37℃、饱和湿度、CO2体积分数为5%?的培养箱内开始原代培养3?4天后；将无菌培养瓶内培养液和未贴壁的细胞倒掉，并重新加入相同体积的培养液，置于上述培养箱内继续培养直至无菌培养瓶内细胞达到75～85%的融合度后，倒掉无菌培养瓶内培养液；将浓度为0.25%的胰蛋白酶溶液按20%培养液体积的添加量加入到无菌培养瓶内，37℃消化1～5分钟后，将无菌培养液倒入无菌培养瓶内终止消化，拍打晃动培养瓶，使细胞完全脱落，将完全脱落的细胞和培养液倒入离心管内，于1000～2000rpm离心5～10分钟，将离心所得的沉淀用含10%胎牛血清的培养液混匀沉淀；重复上述步骤进行二代培养，收集二代培养过程中完全脱落细胞即得到亚全能干细胞；??????（3）亚全能干细胞冻存????将含10%胎牛血清的培养液和?99%?二甲基亚砜按体积比3:1的比例缓慢混匀后配置成冻存液，放入冰水混合物中预冷15～20min，将预冷过的冻存液慢加入到含有亚全能干细胞的冻存管中，将冻存管放入程控降温仪进行预冷，开始冻存程序，将温度降至?80～?90.0℃后取出冻存样本，放入液氮储存罐长期保存。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈正琳，陈平，李杰，夏佳音，
申请(专利权)人：宁波普莱森特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：