本发明专利技术提供了一种油茶良种长林4号和32号的分子特异性标记引物，所述引物序列为：上游引物：5′-CCTATGGTGCCTCTTTGTTTGATGT-3′；上游引物：5′-GTGACAAGTTGAACTCTAGCACAAA-3′。本发明专利技术分子特异性标记引物可对油茶良种长林4号或32号进行快速的早期鉴别，方法简单、快捷、准确，是表观特征辨别油茶良种所不能替代的分子手段。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及油茶良种长林4号和长林32号的分子特异性标记引物，以及利用该引物对油茶良种长林4号和长林32号进行快速鉴定的方法。
技术介绍
油茶是我国栽植面积最大、分布范围较广的木本油料树种。大力发展油茶产业，对保障粮油安全，促进农民增收，推进山区综合开发和建设社会主义新农村，都具有十分重要的意义。我国油茶产业方兴未艾，发展潜力巨大。目前，我国油茶林总面积达4500多万亩，但产量很低，每亩产茶油仅4公斤左右。其根本原因是，绝大部分油茶林品种品质差或严重退化，而大量的国家和省级审(认)定的优良品种又未推广应用。同时，一些地方种苗质量意识淡薄，经营管理粗放。为保障油茶产业又好又快发展，要充分认识油茶良种对发展油茶产业的重要性，必须加快油茶优良种苗发展和强化质量管理。我国目前对油茶种苗质量的监督管理，主要依靠在管理层面制定的各项制度，而在技术层面尚未取得关键性突破，特别是缺乏油茶良种的早期快速鉴别技术体系。目前通过国家林木良种审定的9个长林品种系列分别为3号、4号、18号、21号、23号、27号、40号、53号、55号。这些油茶良种具有早实丰产、稳产、出籽率高、含油量高、抗性强、适应性广等特点。对油茶种苗质量的监督管理要着力解决目前生产上油茶种苗的混乱局面，并首先从技术层面上对长林油茶良种进行鉴别保护。对油茶品种的鉴别主要依据表观特征，但由于许多形态性状鉴定的周期长、受环境影响大，并且品种数量不断增多，使得品种鉴定愈来愈困难。自本世纪以来，一些基于PCR的分子标记技术如RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA,随机扩增多态性DNA)、ISSR (Inter-Simple Sequence Repea,简单序列重复区间扩增多态性)和SRAP(sequence-related amplified polymorphism,相关序列扩增多态性)相继用于油茶的种质资源遗传多样性、遗传距离研究，但对于分子标记与油茶性状的连锁、油茶品种间的分子鉴别研究很少，况且这些分子标记所采用的或为通用随机引物或为成套设计引物的随机组合，其PCR扩增图谱不仅复杂、重复性差，而且特异性不高，因此并不适合用于品种鉴定。SCAR (Sequence Characterized Amplified Region,特征性片段扩增区域)标记是 1993 年由Paran和Michelmore在RAPD基础上提出的，它基于对特异RAPD片段的测序，根据两端序列设计一对18 24碱基的引物，在较高的退火温度下进行特异扩增实现的，其专一性引物的采用排除了随机引物结合位点之间的竞争，因而它是一种十分稳定的分子标记，在应用上具有迅速、简便、低成本的特点，迄今为止，尚未有SCAR标记应用于油茶品种鉴别的研究报道。
技术实现思路
本专利技术目的提供油茶良种长林4号和长林32号的分子特异性标记引物，以及一种能对油茶良种长林4号和长林32号进行快速鉴定的方法。本专利技术采用的技术方案是:油茶良种长林4号和长林32号的分子特异性标记引物，所述引物序列为:上游引物:5'-CCTATGGTGCCTCTTTGTTTGATGT-3'；上游引物:5'-GTGACAAGTTGAACTCTAGCACAAA-3'。该引物对是采用PCR技术，经过大量筛选试验，采用ISSR标记为引物获得油茶良种长林4号和长林32号的特异性DNA片段，将该片段克隆测序，以得到的DNA序列为基础，所设计的特异性引物，以该引物对油茶良种长林4号和长林32号进行PCR扩增，可获得350bp大小的特异性片段。需要说明的是，本专利技术分子特异性标记引物仅限于油茶良种的鉴定(鉴定其是否为长林4号或32号)，即待测样品仅限于油茶。本专利技术还涉及一种所述的分子特异性标记引物对油茶良种长林4号和长林32号进行快速鉴定的方法，所述方法为:提取待测油茶品种叶片的基因组DNA作为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现350bp的DNA条带，则待测油茶品种为油茶良种长林4号或长林32号；反之则否；所述分子特异性标记引物序列为:上游引物5' -CCTATGGTGCCTCTTTGTTTGATGT-3'；上游引物5' -GTGACAAGTTGAACTCTAGCACAAA-3'。本专利技术方法关键在于扩增引物的选择，DNA提取、PCR反应体系及反应条件确定，以及电泳检测，均可按照本领域常规方法进行。优选的，本专利技术所述PCR反应体系组成如下:PCRBuffer终浓度为IxdNTPsI mmol/LMgCb2.5 mmol/LTaq DNA 酶1.0 U/反应上、下游引物各0.4 |iM模板DNA60 ng/反应 余量为dd.H20;PCR反应条件如下:95°C预变性 4min 后；95°C变性 lmin，60°C退火 30s，72°C延伸 lmin，共 30 个循环；最后于72°C补平7min，终止温度为4°C。PCR Buffer终浓度为IX，是指PCR Buffer中各组分在反应体系中的浓度与IXPCR Buffer相同，通常选用体积为反应体系体积1/10的lOXPCRBuffer。IOXPCRBuffer 成分为:100mM Tris-HCl (ρΗ8.5)、500mM KCl、25mM MgCl2 和 1.0%Triton-X_100，溶剂为ddH20。具体的，本发 明所述方法如下:(I)取待测油茶叶片0.0lg，加液氮彻底磨碎，以SDS-CTAB法提取待测油茶叶片的基因组DNA ；(2)以步骤(I)提取的基因组DNA为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增:PCR反应体系每25 μ I组成如下:IOxPCRBuffer2.5 μ IO mmol/L dNTPs2.5 μ 25 mmol/L MgCl22.5 μ 5 U/μΙ Taq DNA SI 0.2 μ ΙΟμΜ上、下游引物各I μ 20 ng/μ 模機 DNA3 μ CidH2O 补足至 25 μ ；PCR反应条件如下:95°C预变性 4min 后；95°C变性 lmin，60°C退火 30s，72°C延伸 lmin，共 30 个循环；最后于72°C补平7min，终止温度为4°C ； (3)取步骤(2)扩增产物5 μ 1，与I μ 10.25%溴酚兰缓冲液混匀，点样于1.5%的琼脂糖凝胶上，于I XTAB缓冲液中、5V/cm电压下电泳，电泳结束后EB染色(在含0.5 μ g/mlEB的水溶液中染色30分钟)，于自动凝胶图像分析仪上照相，若电泳结果出现350bp的DNA条带，则待测油茶为油茶良种长林4号或长林32号；反之则否。本专利技术有益效果主要体现在:本专利技术分子特异性标记引物可对油茶良种长林4号或长林32号进行快速的早期鉴别，方法简单、快捷、准确，是表观特征辨别油茶良种所不能替代的分子手段。附图说明图1为对油茶良种进行PCR扩增的结果；M*DNA分子量标准；箭头所指为从编号为2的油茶良种长林4号和编号为6的油茶良种长林32号扩增出的分子量为350bp的特殊DNA条带；其余编号为其它的油茶良种。具体实施例方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本发本文档来自技高网...
【技术保护点】
油茶良种长林4号和32号的分子特异性标记引物，所述引物序列如下：上游引物：5′?CCTATGGTGCCTCTTTGTTTGATGT?3′；上游引物：5′?GTGACAAGTTGAACTCTAGCACAAA?3′。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李海波，王丽玲，刘本同，钱华，王衍彬，
申请(专利权)人：浙江省林业科学研究院，
类型：发明
国别省市：
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