本发明专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种巨龙竹秆型SSR分子标记鉴定方法。主要包括：筛选SSR引物，从115对巨龙竹SSR引物中筛选出在不同秆型间多态性良好的引物，用于巨龙竹秆型鉴定；用改进的CTAB法提取样品DNA；用筛选出的引物对样品DNA模板进行PCR扩增；对扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；将有效性和特异性好的扩增产物上毛细管电泳读出其等位基因类型；根据巨龙竹的基因型与秆型的相关性，进行准确的秆型鉴定。本发明专利技术还公开了对本方法的可靠性验证。本发明专利技术提供的鉴定巨龙竹秆型的SSR分子标记方法稳定可靠，不受巨龙竹生长环境的影响，可以简便、快速、准确、高通量地应用于巨龙竹通直型优质种源的鉴定。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学领域，涉及一种种源鉴定方法，具体涉及一种基于SSR分子标记鉴定巨龙竹杆型的方法。
技术介绍
巨龙Xs^Dendrocalamus sinicus Chia et J.L.Sun)是世界上目前已知最高大的竹种，特有分布于滇南、滇西南的局部区域，具有较高的经济价值。巨龙竹种质资源分为杆形特征基本稳定2个明显不同的变异类型，即竹杆弯曲、歪扭，竹节变形、缩短的弯曲型巨龙竹和节间正常、节部平滑，竹杆通直、分枝高而少的通直型巨龙竹。造成巨龙竹杆形差异的原因，主要是遗传因素(杜凡等，巨龙竹的变异类型及其引种区划的研究，2001，竹子研究汇刊，20 (1):19-21)。分子标记是以个体间核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接反应。目前，分子标记技术已成为揭示植物种内遗传变异广泛应用的技术。简单序列重复(singlesequence repeat)简称 SSR 或微卫星(microsatellite)序列，大量地存在于大多数真核生物及部分原核生物基因组的非编码区和编码区中，由串联的1-6个核苷酸重复片段构成，长度一般在IOObp以下，具有长度的可变性。简单重复序列分布于巨龙竹整个基因组的不同位置上，不同表现型个体间每个位点上重复单位数目及序列可能不同，因而形成片段长度多态性。由于每个简单重复序列的两端的序列是高度保守的单拷贝序列，因而可根据其两端的序列设计双向引物。通直型巨龙竹杆形特征是竹材工业化利用的优良指标，而弯曲型则不宜工业化利用。由于巨龙竹生长范围狭窄，当前有关巨龙竹的研究手段和方法相对落后。目前，还没有公开文献资料发表关于巨龙竹种源鉴定的方法。因此，专利技术一种可以鉴定遗传稳定的通直型优良种源的方法是当前巨龙竹推广栽培所急需解决的问题。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种能快速、准确的鉴定巨龙竹种源类型的SSR分子标记方法。为实现本上述目的，本专利技术提供了如下技术方案，包括以下步骤。(I)SSR引物筛选:从专利技术人前期设计的115对巨龙竹SSR引物中筛选特异性引物。(2)选取拟鉴定的巨龙竹样品叶片，采用改进的CTAB法提取总DNA。(3)用筛选出的引物分别对样品DNA模板进行PCR扩增。(4)检测PCR扩增产物的有效性和特异性。(5)用扩增效果良好的PCR产物上毛细管电泳，检测等位基因类型。(6)根据巨龙竹的基因型与杆型的相关性，确定样品的杆型。 上述方法，步骤(I)所述的特异性引物的要求是，等位基因类型在通直型和弯曲型个体之间有显著多态性，即等位基因类型不同时为纯合子或杂合子，特异性好，没有明显杂峰。筛选出的5对SSR特异性引物，其核苷酸序列如下表I。权利要求1.一种巨龙竹杆型的SSR分子标记鉴定方法，包括以下步骤:SSR引物筛选，筛选5对特异性引物；选取拟鉴定的巨龙竹样品叶片，采用改进的CTAB发提取总DNA ;分别用每一对引物对样品DNA模板进行PCR扩增；将PCR产物进行电泳检测，检测产物的有效性、特异性；用扩增效果良好的PCR产物上毛细管电泳，检测等位基因类型；根据巨龙竹的基因型与杆型的相关性，确定样品的杆型。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(I)所述的筛选SSR引物要求是，等位基因类型在通直型和弯曲型个体之间有显著多态性，即等位基因类型不同时为纯合子或杂合子，特异性好，没有明显杂峰。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述的SSR引物是从专利技术人根据巨龙竹序列设计115对SSR引物中筛选得到的。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤(3)中，进行PCR扩增时，采用下述扩增体系:20μ I 体系，10μ 12XTaq PCR MasterMix，正反引物(5ng/μ I)各 0.32μ 1，DNA (50 ng/ μ I) 0.6 μ 1，补足 ddH20 至 20 μ I。5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于:所述步骤(3)中，进行PCR扩增时，采用下述扩增程序:94°C预变性3min ;94°C变性30s，引物退火温度退火40s，72°C延伸50s，运行35个循环；72°C延伸7min，4°C低温保存。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述的PCR扩增产物进行的电泳检测采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述的毛细管电泳采用QIAxcel毛细管电泳系统。8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:筛选得到的SSR特异性引物，其核苷酸序列如下表。引物核蕾酸序列 Fr GTCAGGiGGCACMCAAMT DenOOSR: GACCTCTGCTTTCGCATAAF: MACAAAGCCAGTACTCACA Den007R: CTAACCCTGAGCGTGACCAC Fr ATCTAGGTGGTATGAACAAT Den036P.: CGTATGTATTTGTGTATCGG F; TCTGCTITTCTCTCTTGATT DenOSSR: GCTTTCATTTACTGCCCTCT'F; AGAAGAAGGGAACTCACAM Den096P.:1TGTCTTTTTTCGGGGATTC9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述每对引物采用退火温度分别为:Den006，61°C ；Den007, 61°C ；Den036, 50°C ；Den058, 48°C ；Den096, 52°C。10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤(6)中，各对引物等位基因类型和巨龙竹杆型的对应关系如下表。全文摘要本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种巨龙竹秆型SSR分子标记鉴定方法。主要包括筛选SSR引物，从115对巨龙竹SSR引物中筛选出在不同秆型间多态性良好的引物，用于巨龙竹秆型鉴定；用改进的CTAB法提取样品DNA；用筛选出的引物对样品DNA模板进行PCR扩增；对扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；将有效性和特异性好的扩增产物上毛细管电泳读出其等位基因类型；根据巨龙竹的基因型与秆型的相关性，进行准确的秆型鉴定。本专利技术还公开了对本方法的可靠性验证。本专利技术提供的鉴定巨龙竹秆型的SSR分子标记方法稳定可靠，不受巨龙竹生长环境的影响，可以简便、快速、准确、高通量地应用于巨龙竹通直型优质种源的鉴定。文档编号C12Q1/68GK103233066SQ20131013132公开日2013年8月7日 申请日期2013年4月17日 优先权日2013年4月17日专利技术者杨汉奇, 董禹然 申请人:杨汉奇, 董禹然本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种巨龙竹秆型的SSR分子标记鉴定方法，包括以下步骤：SSR引物筛选，筛选5对特异性引物；选取拟鉴定的巨龙竹样品叶片，采用改进的CTAB发提取总DNA；分别用每一对引物对样品DNA模板进行PCR扩增；将PCR?产物进行电泳检测，检测产物的有效性、特异性；用扩增效果良好的PCR产物上毛细管电泳，检测等位基因类型；根据巨龙竹的基因型与秆型的相关性，确定样品的秆型。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨汉奇，董禹然，
申请(专利权)人：杨汉奇，董禹然，
类型：发明
国别省市：
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