本发明专利技术公开了一种检测乙肝病毒核心基因启动子碱基突变的试剂盒及检测方法，该试剂盒包括PCR反应液A、PCR反应液B和PCR反应液C，本发明专利技术方法所使用的引物，主要依靠乙肝病毒核心基因启动子目标基因及其碱基变异碱基设计引物，而且通过未突变(野生型)的反向互补序列引物,在PCR扩增时,对野生型碱基序列的竞争性抑制,而严重阻滞野生株DNA的扩增,准确检测基因变异。该试剂盒检测方便，结果稳定，成本低、敏感性高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学领域，具体涉及一种检测乙肝病毒核心基因启动子碱基突变的试剂盒，还涉及一种乙肝病毒核心基因启动子碱基突变的检测方法。
技术介绍
病毒性乙型肝炎(HB，hePatitisB)是一种世界性的传染性疾病，我国近3千万人的慢性乙型肝炎患者中，其所携带的HBV变异毒株大多数表现为在病毒基因组前C区核心基因启动子碱基变异，HBV BCP区变异在慢性乙型重型肝炎患者中发生率高，提示HBV BCP变异与乙型肝炎发病过程及病情严重程度有关。目前国内外用于检测基因突变的方法有:(I)PCR直接测序:对PCR产物进行的直接序列分析，并与DNA序列片段进行对比分析，检出点突变部位碱基改变。(2)PCR产物限制性内切酶分析:主要用于检测基因点突变发生时引起酶切位点改变的DNA片段，这一方法必须在突变点涉及到限制性内切酶切位点改变时才能使用。(3)PCR—寡核苷酸探针杂交:该方法利用寡核苷酸片段作为探针，在严格控制杂交条件的前提下杂交，杂交温度要求过于严格，很难推广应用。 (4)PCR—单链构象多态性(PCR SSCP):基于序列不同的DNA单链片段，其空间构象亦有所不同，根据其电泳的位置变化，而表现出不同序列单链电泳迁移率的差异，从而判断有无突变存在。(5)使用合成的特定核苷酸引物和分子信标探针，对1762和1764点的靶DNA片段，实时PCR的扩增，根据PCR的扩增，分析并判断标本中乙型肝炎病毒DNA的A1762T-G1764A突变是否存在。(6)其他:如解链温度(Tm)基因突变检测，基因芯片技术等。本研究的方法是反义抑制PCR联合荧光探针检测乙肝病毒核心基因启动子碱基变异方法及其所使用的引物。该方法的原理为:根据乙肝病毒核心基因启动子碱基变异设计聚合酶链DNA引物，引物序列的3'端位在突变碱基，又根据未突变(野生型)的DNA引物3'端碱基序列，从序列3'端倒数第I位设计反向引物的互补序列。这样，PCR扩增时，通过对野生型碱基序列的竞争性抑制，严重阻滞了野生株DNA的扩增，存在PCR反应液内的荧光探针报告基团分离也被阻滞，发射荧光程度显著减弱，而对变异的碱基序列扩增，几乎不产生阻滞，存在PCR液内的荧光探针报告基团可正常分离而发荧光，因此在检测同一标本时，通过此检测值差别的比较，可准确地判断基因变异。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供了一种检测乙肝病毒核心基因启动子碱基突变的试剂盒，该试剂盒检测方便，结果稳定。本专利技术还有一个目的是提供了一种检测乙肝病毒核心基因启动子碱基突变的方法，该方法成本低、敏感性高、稳定性好、操作简单。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案:本专利技术的核心技术在于:根据乙肝病毒核心基因启动子目标基因及其碱基变异设计聚合酶链DNA引物，弓I物序列的:T端位在突变碱基，又根据未突变(野生型)的DNA引物3'端碱基序列，从序列3'端倒数第I位反向设计引物互补序列，PCR扩增时，通过对野生型碱基序列的竞争性抑制，而严重阻滞野生株DNA的扩增，而几乎对变异的碱基序列扩增不产生阻滞。在检测同一标本时，设立不加此互补序列的PCR反应液作对照，根据对同一标本检测的CT值差别比较，可准确判断乙肝病毒核心基因启动子目标基因碱基变异。本专利技术所述试剂盒是针对乙肝病毒核心基因启动子A1762T和G1764A位碱基变异。确定检测A1762T位和G1764A位碱基变异靶基因(GENE-BANK AB198078)为:gtttaaagactgggaggagt tgggggagga gattaggtta aaggtctttg tactaggagg ctgtaggcat aaattggtctgttcaccagc accatgcaac tttttcacct ctgcctaatc atctcatgtt catgtcctac tgttcaagcctccaagctgt gccttgggtg get。一种检测乙肝病毒核心基因启动子碱基突变的试剂盒，包括以下成分:PCR试剂盒A组试剂:对乙肝病毒核心基因启动子碱基的野生型和突变型都能顺利进行PCR扩增，包括以下成分:PCR 反应液 A:PC R 缓冲液(I X )、TaqDNA 聚合酶 1.5U、dNTP0.3 μ mol/LHBV-A1 上游引物 5' -gttta aagac tggga ggagt-31 0.3 μ mol/LHBV-D 公用下游引物 5' -agcca cccaa ggcac agctt g-3' 0.3 μ mol/LHBV-Y 突光探针:5' -FAM-tgtag gcata aattg gtctg tt-TAMARA-3' ；0.2 μ mol/LPCR试剂盒B组试剂:对乙肝病毒核心基因启动子A1762T碱基的突变型能顺利进行PCR扩增，而对其野生型PCR扩增受到严重阻滞，包括以下成分:PCR 反应液 B:PCR 缓冲液(I X )、TaqDNA 聚合酶 1.5U、dNTP0.3 μ mol/L 以及HBV-Bl 上游引物 5' -tgggg gagga gatta ggtta at~3/ 0.3 μ mol/LHBV-B2 上游反义引物 5' -tttaa cctaa tctcc tcccc ca~3' 0.03 μ mol/LHBV-D 公用下游引物 5' -agcca cccaa ggcac agctt g-3' ；0.3 μ mol/LHBV-Y 突光探针:5' -FAM-tgtag gcata aattg gtctg tt-TAMARA-3' ；0.2 μ mol/LPCR试剂盒C组试剂:对乙肝病毒核心基因启动子G1764A碱基的突变型能顺利进行PCR扩增，而对其野生型PCR扩增受到严重阻滞，包括以下成分:PCR 反应液 C:PCR 缓冲液(I X )、TaqDNA 聚合酶 l_2u、dNTP0.3 μ mol/L 以及HBV-C1 上游引物 5' -ggagg agatt aggtt aaaga-3' 0.3 μ mol/LHBV-C2 上游反义引物 5' -ccttt aacct aatct cctcc-3' 0.03 μ mol/LHBV-D 公用下游引物 5' -agcca cccaa ggcac agctt g-3' 0.3 μ mol/LHBV-Y 突光探针:5' -FAM-tgtag gcata aattg gtctg tt-TAMARA-3' 0.2 μ mol/LI)样本DNA处理:取待测血清样本30μ I加入等量DNA提取液60 μ I混匀，95-980C 8—9分钟变性，放置冰箱(TC冷却2_3分钟，12000rpm离心5分钟，取上清液离心备用。2)PCR反应液分装:各取PCR反应液A、B和C，各25 μ 1，取待测检测提取HBV DNA上清液5 μ I加入各反应管。3) PCR扩增:取分装好PCR反应液的各反应管，按以下PCR扩增条件设置并扩增:940C 3分钟预变性，然后93 °C 40秒-55 °C 60秒循环40次。4)检测结果与判断:(I)应用PCR试剂盒A组试剂检测乙肝病毒核心基因启动子DNA的判断:DNA检测阴性:CT值彡38 ; DNA 检测阳性:CT 值〈36。DNA检测灰区:36〈CT值本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测乙肝病毒核心基因启动子碱基突变的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括以下成分：PCR试剂盒A组试剂：?PCR反应液A:PCR缓冲液、TaqDNA聚合酶、dNTP?HBV?A1上游引物??????5′??gttta??aagac??tggga??ggagt???3′???HBV?D公用下游引物??5′??agcca??cccaa??ggcac??agctt??g???3′??HBV?Y荧光探针:?5′?FAM?tgtag??gcata??aattg??gtctg?tt???TAMARA?3′；PCR试剂盒B组试剂：?PCR反应液B:PCR缓冲液、TaqDNA聚合酶、dNTP??HBV?B1上游引物????5′??tgggg??gagga?gatta??ggtta?at???3′??HBV?B2上游反义引物????5′??tttaa??cctaa??tctcc??tcccc??ca?3′??HBV?D公用下游引物???5′??agcca??cccaa??ggcac??agctt??g??3′HBV?Y荧光探针:?5′?FAM?tgtag??gcata??aattg??gtctg?tt???TAMARA?3′；PCR试剂盒C组试剂：?PCR反应液C:PCR缓冲液、TaqDNA聚合酶、dNTP??HBV?C1上游引物???????5′??ggagg??agatt??aggtt??aaaga??3′?????HBV?C2上游反义引物???5′??ccttt??aacct??aatct??cctcc??3′????HBV?D公用下游引物????5′??agcca??cccaa??ggcac??agctt??g???3′??HBV?Y荧光探针:?5′?FAM?tgtag??gcata??aattg??gtctg?tt???TAMARA?3′。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：夏晓兵，糜克永，刘静，占霖，张易莎，
申请(专利权)人：武汉珈创生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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