本发明专利技术公开了一种检测鼠腺病毒的荧光定量PCR试剂盒及应用，该试剂盒含有：a）DNA提取液、b)引物、c)标准阳性模板、d)SYBRGreenI实时荧光定量PCR反应液，其特征在于：从细胞样品中提取DNA，进行荧光定量PCR反应，同时引入标准阳性模板，引物序列分别为正义引物：5’-ATAAGAAAGGATGCGGAAAAGGAC-3’，反义引物：5’-CCCAAAACAGAAGCAACAGAGTAA-3’，扩增子大小为170bp，标准阳性DNA模板由已插入鼠腺病毒保守的病毒DNA连接蛋白编码区170bp的pTA2载体转化大肠杆菌DH5α，增殖后提取质粒，并于紫外分光光度计测A260定量并10倍梯度稀释。结果更加准确、可靠、稳定性好、重复性好。灵敏度高、定量快速准确、检测范围广。也可以进行鼠腺病毒引起的流行病学调查，还可以为相关基础研究提供技术支持，应用前景十分广泛。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，更具体涉及一种检测鼠腺病毒的SYBR Green I实时荧光定量PCR试剂盒，同时还涉及SYBR Green I实时荧光定量PCR试剂盒的应用，该SYBR Green I实时荧光定量PCR试剂盒可高效方便的对各种生物材料的小鼠源腺病毒进行定量检测和质量监控，也可以进行鼠腺病毒的流行病学调查，还可以为相关基础研究提供技术支持，应用前景十分广泛。
技术介绍
鼠腺病毒(Murineadenovirusl, MAdV-1)属腺病毒科(Adenoviridae)哺乳动物属(Mastad enovirus)。腺病毒无囊膜，病毒粒子为二十面体，直径为80 IlOnm,由252个壳粒组成。一般感染哺乳动物的腺病毒相对分子质量为20 25X 106，G+C含量为48% 61%。腺病毒分布十分广泛，一般对 于人体没有致癌性，但是腺病毒容易导致呼吸道感染，如急性发热性咽喉炎、咽结膜热和肺炎等。鼠腺病毒可损害人类心血管组织，被怀疑为人类心脏损害的一种病原。因此，对小鼠慢性持续性鼠腺病毒感染诊断，对控制鼠腺病毒蔓延、防治具有积极意义。目前检测技术一般来说有血清学诊断技术、生物学试验、分子生物学诊断技术三类:1、血清学诊断技术包括免疫荧光技术(IFA)、双抗体夹心ELISA检测等。但由于所有实验均用到抗血清和抗原免疫反应，所以反应时间长、材料多、准备周期长，而且检测具有明显的滞后性，只能定性不能定量，而且重复性差。2、生物学试验包括动物实验、鸡胚接种和细胞培养。这种检测方法存在不敏感问题，而且有些样品存在抗补体活性，影响检测效果。动物实验成本较高、检测周期长，耗费大量生物资源和人力物力。3、分子生物学诊断技术，即应用PCR技术检测鼠腺病毒持续感染。相比之下，PCR方法特异性好，检测灵敏度高，不但可以检测活病毒核酸，也能直接检测灭活的核算片段。但普通的PCR检测方法测定的都是PCR的终产物，而不是起始的DNA或RNA拷贝数。由于PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以无法定量起始的DNA或RNA拷贝数。近年发展起来的突光定量PCR技术(Fluorogenetic Quantitative PCR, FQ-PCR)有灵敏度高、速度快、特异性好等优点。目前使用比较多的是SYBR Green I荧光染料法和Taqman法。两种方法都具有灵敏度高、检测速度快、特异性好的优点。在基因表达水平分析(N ellemann C, Vinggaard AM, Dalagaard M, et al.Quantification of AntiandrogenEffect Det ermined by Light Cycler Technology[J].Toxicology, 2001，163:29-38)、病原体的定性(Bhu devi B, Weinstock D.Fluorogenic RT-PCR assay (TaqMan)for Detection and Classificatio n of Bovine Viral Diarrhea Virus[J].Vet.Microbiol., 2001, 83:1-10.)和定量检测(Kathy F.J.Tang, Jun Wang, DonaldV.Lightner.Quantitation of Taura syndrome virus by real-time RT-PCR witha TaqMan assay[J].J.Virol.Methods, 115(2004) 109-114.;Birgit Liss.1m provedquantitative real-time RT-PCR for expression profiling of individual cells[J].Nucle ic Acids Res. , 2002, Vol. 30No. 17e89. Florence KP, Glaucia PB, Mireille S, etal. Quantit ation of HCV RNA using real-time PCR and fluorimetry[J]. J. Virol.Methods, 2001, 95:111-119.)等方面得到广泛应用，并且已成为当前病毒核酸定量的主要方法。目前使用比较多的荧光定量PCR方法有SYBR Green I荧光染料法和TaqMan法，这两种方法都具有灵敏度高、检测速度快、特异性好的优点。本专利技术所采用的基于SYBR GreenI荧光染料技术的荧光定量PCR检测方法其引物设计、合成更加简便。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供了一种检测鼠腺病毒的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒适用于目前市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，结果更加准确、可靠、稳定性好、重复性好。灵敏度高、定量快速准确、检测范围广。本专利技术的另一个目的是在于提供了一种鼠腺病毒的荧光定量PCR试剂盒在检测(抗)鼠腺病毒药物研究中的应用，可对小鼠、大鼠细胞制品进行定量检测和质量监控，也可以进行鼠腺病毒引起的流行病学调查，还可以为相关基础研究提供技术支持，应用前景十分广泛。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术措施一种检测鼠腺病毒的SYBR Green I实时荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒含有a)DNA提取液、b)引物、c)标准阳性模板、d) SYBR Green I实时荧光定量PCR反应液，其特征在于从细胞样品中提取DNA，进行荧光定量PCR反应，同时引入标准阳性模板，定量检测未知样品。引物序列分别为正义引物5’-ATAAGAAAGGATGCGGAAAAGGAC-3’，反义弓 I 物5 ’ -CCCAAAACAGAAGCAACAGAGTAA-3 ’，扩增子大小为170bp。标准阳性DNA模板由已插入鼠腺病毒保守的病毒核心DNA连接蛋白编码`区170bp的pTA2载体转化大肠杆菌DH5 α (本实验室保存，大肠杆菌DH5ci为最常用于常规克隆应用的大肠杆菌菌株。除支持蓝/白筛选外,DH5 α的recAl和endAl突变可增强嵌入稳定性并提高自minipreps制备的质粒DNA质量)，增殖后提取质粒，并于紫外分光光度计测A26tl定量并10倍梯度稀释。所述的DNA 提取液是由 5mL100mM Tris-HCl (ρΗ=8· 5)、0· 5mL0. 5M EDTA,lmL10%SDS、2mL5M NaCl、0. 25mL0. 2mg/mL 蛋白酶 K 和 41. 25mL 灭菌的双蒸水组成。所述的SYBR Green I实时荧光定量PCR反应液是由2XiTaq SYBR Green Supermix (with R0X)、10 μ M的正义引物和反义引物和灭菌的双蒸水组成。所述的标准阳性DNA模板核苷酸序列为Ataagaaaggatgcggaaaaggaccgcatcgttgaagacataacaaattagtaaaaggtacaacataggatgtaaaatagccaatga ccatatgatcaccgcgcggacatgccgctcggagggttttgtgagctttttgcagaactttactctgttgcttctg本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测鼠腺病毒的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒含有：a）DNA提取液、b)引物、c)标准阳性模板、d)?SYBR?Green?I实时荧光定量PCR反应液，其特征在于：从细胞样品中提取DNA，进行荧光定量PCR反应，同时引入标准阳性模板，引物序列分别为正义引物：5’?ATAAGAAAGGATGCGGAAAAGGAC??3’，反义引物：5’?CCCAAAACAGAAGCAACAGAGTAA??3’，扩增子大小为170bp，标准阳性DNA模板由已插入鼠腺病毒保守的病毒DNA连接蛋白编码区170bp的pTA2载体转化大肠杆菌DH5α，增殖后提取质粒，并于紫外分光光度计测A260定量并10倍梯度稀释。
【技术特征摘要】
1.一种检测鼠腺病毒的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒含有:a) DNA提取液、b)引物、c)标准阳性模板、d) SYBR Green I实时荧光定量PCR反应液，其特征在于:从细胞样品中提取DNA，进行荧光定量PCR反应，同时引入标准阳性模板，引物序列分别为正义引物:5，-ATAAGAAAGGATGCGGAAAAGGAC _3 ’，反义引物:5 ’ -CCCAAAACAGAAGCAACAGAGTAA _3 ’，扩增子大小为170bp，标准阳性DNA模板由已插入鼠腺病毒保守的病毒DNA连接蛋白编码区170bp的pTA2载体转化大肠杆菌DH5 α，增殖后提取质粒，并于紫外分光光度计测A26tl定量并10倍梯度稀释。2.根据权利要求1所述的一种检测鼠腺病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于:所述的 DNA 提取液是由 5mL IOOmM Tris_HClpH=8.5、0.5mL 0.5M EDTAUmL 10%SDS、2mL5MNaCl>0....
【专利技术属性】
技术研发人员：肖庚富，张哲，郑从义，
申请(专利权)人：武汉珈创生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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