本发明专利技术公开了一种检测小鼠痘病毒的荧光定量PCR试剂盒及应用，该试剂盒含有：a)DNA提取液、b)引物、c)标准阳性模板、d)SYBRGreenI实时荧光定量PCR反应液，从细胞样品中提取DNA，进行荧光定量PCR反应，同时引入标准阳性模板，引物序列分别为正义引物：5’-GCCGTCATTCCTAAAAAAAGTGGT-3’，反义引物：5’-ATCAAAGCCTTGTTGTCTCCGA-3’，扩增子大小为176bp，标准阳性DNA模板由已插入小鼠痘病毒保守的病毒核心DNA连接蛋白编码区176bp的pTA2载体转化大肠杆菌DH5α，增殖后提取质粒，并于紫外分光光度计测A260定量并10倍梯度稀释。结果更加准确、可靠，重复性好。灵敏度高、定量快速准确、检测范围广、稳定性好。也可以为相关基础研究提供技术支持，应用前景十分广泛。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，更具体涉及一种检测小鼠痘病毒的SYBR Green I实时荧光定量PCR试剂盒，同时还涉及SYBR Green I实时荧光定量PCR试剂盒的应用，该SYBRGreen I实时荧光定量PCR试剂盒可高效方便的对小鼠细胞制品进行定量检测和质量监控，也可以进行小鼠痘病毒的流行病学调查，还可以为相关基础研究提供技术支持，应用前景十分广泛。
技术介绍
小鼠痘病毒(Ectromelia virus, ECTV)属痘病毒科(Poxviridae)脊椎动物痘病毒亚科(Chor dopoxvirinae)正痘病毒属(Orthpoxvirus),是一种单一分子双链DNA病毒，病毒粒子为砖形，大小为200nmX200nmX250nm，对乙醚抗性。其基因组序列与天花病毒有很大的相似性，因此《中华人民共和国药典》规定对鼠源性生物制品必须检测小鼠痘病毒。小鼠痘病毒感染有急性和慢性两种形式，常见实验室烈性传染性脱脚病就是由小鼠痘病毒急性感染引起，临床表现为四肢、尾和头部肿胀、溃烂、坏死甚至脚趾脱落为特征。慢性感染中主要为持续性感染，小鼠痘病毒慢性持续性感染小鼠没有明显临床症状，是诱发脱脚病或产生病毒传染的主要因素。因此，对实验小鼠慢性持续性小鼠痘病毒感染诊断，对控制小鼠痘病毒蔓延、防止脱脚病发生具有积极意义。目前检测技术一般来说有血清学诊断技术、生物学试验、分子生物学诊断技术三类I、血清学诊断技术包括免疫荧光技术(IFA)、双抗体夹心ELISA检测等。但由于所有实验均用到抗血清和抗原免疫反应，所以反应时间长、材料多、准备周期长，而且检测具有明显的滞后性，只能定性不能定量，而且重复性差。2、生物学试验包括动物实验、鸡胚接种和细胞培养。这种检测方法存在不敏感问题，而且有些样品存在抗补体活性，影响检测效果。动物实验成本较高、检测周期长，耗费大量生物资源和人力物力。`3、分子生物学诊断技术，即应用PCR技术检测小鼠痘病毒持续感染。PCR方法特异性好，检测灵敏度高，不但可以检测活病毒核酸，也能直接检测灭活的核酸片段。在上世纪90年代，国内就有报道使用PCR技术建立检测小鼠痘病毒的方法，最低检出小鼠痘病毒DNA量为O. Ipgo由于PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以该方法无法定量起始的DNA或RNA拷贝数。近年发展起来的荧光定量PCR(FluorogeneticQuantitative PCR, FQ-PCR)技术有灵敏度高、速度快、特异性好等优点。在基因表达水平分析(Nellema nn C, Vinggaard AM, Dalagaard M, et al. Quantification of AntiandrogenEffect Determin ed by Light Cycler Technology[J] · Toxicology, 2001，163:29-38)、病原体的定性(Bhudevi B, Weinstock D. Fluorogenic RT-PCR assay (TaqMan)for Detection and Classification of Bovine Viral Diarrhea Virus[J]. Vet.Microbiol. , 2001, 83:1-10.)和定量检测(Kathy F. J. Tan g, Jun Wang, DonaldV.Lightner. Quantitation of Taura syndrome virus by real-time RT-P CR witha TaqMan assay[J].J.Virol.Methods, 115(2004) 109-114.;Birgit Liss.1mprove dquantitative real-time RT-PCR for expression profiling of individual cells[J].Nucleic Ac ids Res., 2002, Vol.30N0.17e89.Florence KP, Glaucia PB, Mireille S,etal.Quantitation of HCV RNA using real-time PCR and fluorimetry[J].J.Virol.Methods, 2001, 95:111-119.)等方面得到广泛应用，并且已成为当前病毒核酸定量的主要方法。目前使用比较多的荧光定量PCR方法有SYBR Green I荧光染料法和TaqMan法，这两种方法都具有灵敏度高、检测速度快、特异性好的优点。M.SofiIbrahim等(2003)使用基于TaqMan探针的real-time PCR法检测天花病毒,最低检测浓度能达到Ifg/ μ L(25copies),比普通PCR方法灵敏100倍。Luo A-dong等(2008)使用SYBR Green I荧光染料建立山羊痘病毒荧光定量PCR检测方法，最低能检测700COpieS DNA样品。SYBR Green I荧光染料法和TaqMan探针法在灵敏度上相差不大。目前，国内已有基于TaqMan探针技术的real-timePCR检测小鼠痘病毒的专利方法，“用于检测小鼠脱脚病病毒的引物、探针及其方法(申请公布号CN102329889A)”。本专利技术所采用的基于SYBR Green I荧光染料技术的荧光定量PCR检测方法其引物设计、合成更加简便。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供了一种检测小鼠痘病毒的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒适用于目前市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，结果更加准确、可靠，重复性好。灵敏度高、定量快速准确、检测范围广、稳定性好。本专利技术的另一个目的是在于提供了一种荧光定量PCR试剂盒在检测(抗)小鼠痘病毒药物研究中的应用，可对小鼠、大鼠细胞制品进行定量检测和质量监控，也可以进行小鼠痘病毒引起的烈性传染性脱脚病的流行病学调查，还可以为相关基础研究提供技术支持，应用前景十分广泛。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术措施:一种检测小鼠痘病毒的SYBR Green I实时荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒含有:a) DNA提取液、b)引物、c)标准阳性模板、d) SYBR Green I实时荧光定量PCR反应液，其特征在于:从细胞样品中提取DNA，进行荧光定量PCR反应，同时引入标准阳性模板，定量检测未知样品。引物序列分别为正义引物:5 ’ -GCCGTCATTCCTAAAAAAAGTGGT-3 ’，反义引物:5’ -ATCAAAGCCTTGTTGTCTCCGA-3’，扩增子大小为176bp。标准阳性DNA模板由已插入小鼠痘病毒保守的病毒核心DNA连接蛋白编码区176bp的pTA2 (购自Τ0Υ0Β0公司)载体转化大肠杆菌DH5ci (本实验室保存，大肠杆菌DH5ci为最常用于常规克隆应用的大肠杆菌菌株。除支持蓝/白筛选外，DH5 α的recAl和endAl突变可增强嵌入稳定性并提高自minipreps制备的质粒DNA质量)，增殖后提取质粒，并于紫外分光光度计测A26tl定量并10倍梯度稀释。所述的DNA 提取液是由 5mL100mM Tris-HCl (ρΗ=8本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测小鼠痘病毒的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒含有：a)DNA提取液、b)引物、c)标准阳性模板、d)?SYBR?Green?I实时荧光定量PCR反应液，其特征在于：从细胞样品中提取DNA，进行荧光定量PCR反应，同时引入标准阳性模板，引物序列分别为正义引物：5’?GCCGTCATTCCTAAAAAAAGTGGT?3’，反义引物：5’?ATCAAAGCCTTGTTGTCTCCGA?3’，扩增子大小为176bp，标准阳性DNA模板由已插入小鼠痘病毒保守的病毒核心DNA连接蛋白编码区176bp的pTA2载体转化大肠杆菌DH5α，增殖后提取质粒，并于紫外分光光度计测A260定量并10倍梯度稀释。
【技术特征摘要】
1.一种检测小鼠痘病毒的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒含有:a)DNA提取液、b)引物、c)标准阳性模板、d) SYBR Green I实时荧光定量PCR反应液，其特征在于:从细胞样品中提取DNA，进行荧光定量PCR反应，同时引入标准阳性模板，引物序列分别为正义引物:5’ -GCCGTCATTCCTAAAAAAAGTGGT-3’，反义引物:5’ -ATCAAAGCCTTGTTGTCTCCGA-3’，扩增子大小为176bp，标准阳性DNA模板由已插入小鼠痘病毒保守的病毒核心DNA连接蛋白编码区176bp的pTA2载体转化大肠杆菌DH5 α，增殖后提取质粒，并于紫外分光光度计测A26tl定量并10倍梯度稀释。2.根据权利要求1所述的一种检测小鼠痘病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于:所述的 DNA 提取液是由 5mL IOOmM Tris_HClpH=8.5、0.5mL 0.5M EDTAUmL 10%SDS、2mL5MNaCl>0.25mL ...
【专利技术属性】
技术研发人员：肖庚富，张哲，郑从义，
申请(专利权)人：武汉珈创生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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