本发明专利技术公开了一种检测人细胞色素P450相关的基因多态位点的引物系统。基于该引物系统所制备的产品，能实现同时对人细胞色素P450相关的7处基因多态位点进行检测。使用该产品，通过检测与人细胞色素P450相关基因多态位点，可以进行临床用药方案指导和调整，为临床个体化用药提供依据，预防药物不良反应等。本发明专利技术能在一个反应体系内对不同基因上的7处基因多态位点同时进行检测，较测序、实时荧光定量PCR等技术成本更低，操作更简便，准确度和灵敏度提高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及一种用于确定人细胞色素P450相关的基因多态性位点(SNP)的检测方法及产品，具体而言是利用多重PCR技术、单碱基延伸技术和质谱技术，对人细胞色素P450相关的7个基因多态位点进行检测的方法及相应的试剂盒。
技术介绍
细胞色素P450酶(cytochrome P450, CYP),又称混合功能氧化酶(mixed functionoxidase)和单加氧酶(monooxygenase),主要存在于肝脏微粒体中，人体中其他组织例如:脑、肺、肾脏、皮肤、胎盘、胃肠道、乳腺等也可产生。细胞色素P450在外源性物质(包括药物和毒物)的代谢中起着十分重要的作用，它的活性决定药物的代谢速率，与药物的清除率有着直接关系，是药物代谢的第一相酶，因而又称为药物代谢酶。P450酶系的基因主要有CYP1、CYP2、CYP3三个家族，相关的有以下几种重要的P450酶:CYP1A2、CYP2A6、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4、CYP3A5。目前，困扰临床医疗和制药行业最常见的问题是不同病人对同一药物的反应不同，表现为不同的药物疗效和毒副作用。联合国世界卫生组织统计:全球死亡患者中，三分之一是死于不合理用药，我国国家卫生部药品不良反应监察中心的数据为:住院病人中，每年约有20万人死于药物不良反应。CYP家族参与代谢的药物约占市场上销售药物的80%以上，一旦酶的功能发生变化，会影响药物的代谢和疗效。在药物不良反应研究中，大约48%所选用的药物是由P450代谢的，P450酶基因的多态性与大量的药物不良反应密切相关。CYP450遗传多态性可能引起CYP450酶缺失、表达量降低或增高，底物特异性改变等，从而引起药物代谢动力学的改变。CYP450的遗传多态性导致不同个体对同一药物产生不同药物应答，其中CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP1A2具有明显的遗传多态性，在药物代谢过程中发挥重要作用，涉及胃肠病药物、心血管药物、镇痛药、肌肉与骨骼用药、眼科药物等多种用药。CYP450基因多态性造成酶代谢功能的变化，这种变化存在显著的患者个体之间的差异。可以将用药人群分为四种代谢表型:慢代谢型(PM)、中间代谢型(IM)、快代谢型(EM)和超快代谢型(UM)。正常野生型表现为快代谢型:肝脏代谢药物的能力正常，药物代谢的速率正常；绝大多数突变型为慢代谢型:对药物代谢速率过慢，导致药物血药浓度过高，对肝脏的毒性最大，引起药物不良反应。中间代谢型:肝脏代谢药物的能力弱，药物代谢的速率慢，药物对肝脏的毒性大；极少数突变型因基因多拷贝重复造成酶的过量表达，为超快代谢型:肝脏代谢药物的能力较强，药物代谢的速率较快，导致药物治疗效果差。CYP450遗传多态性是产生药物毒副作用、降低或丧失药物疗效的主要原因之一。通过CYP450基因型检测可以进行临床用药方案指导和调整，为临床个体化用药提供依据，预防药物不良反应等。CYP2C19基因外显子5第681位碱基G>A突变(rs4244285)，导致转录过程中外显子5’端40bp (643-682bp)缺失，翻译过程中丢失215-227位氨基酸，并从215位氨基酸处发生移码，在其下游第20个氨基酸处产生异常终止密码，蛋白合成过早终止，合成仅含234个氨基酸的短蛋白，为缺失血红素结合区的无功能蛋白。73-83%的PM表型个体携带rs4244285 突变。CYP2C19基因外显子4第636位碱基G>A突变(rs4986893)，编码色氨酸的密码子突变为终止密码子，导致蛋白合成提前终止，形成无血红素及底物结合区的无功能蛋白。在中国人群中，rs4986893突变的发生频率为rs4244285突变的1/9-1/10，这两种突变几乎可以解释所有的PM表型。CYP2C9基因具有遗传多态性，其中最常见的为CYP2C9*2 (rsl799853)、CYP2C9*3(rsl057910)等基因多态位点，这些位点突变后，基因编码酶的活性较野生型大幅降低，导致患者对药物的代谢及清除能力大幅降低，临床表现出对药物的敏感性，需要减量给药以减少不良反应的发生。综上所述，基因多态位点是导致不同个体对同一药物产生不同应答的因素之一，用药前进行相关的基因多态性检测，结合临床因素，有助于为患者指导用药，降低严重不良反应的发生率。目前常用的检测技术中，测序需对多个位点逐一进行检测，操作复杂，费用较高。芯片法虽可检测多个位点，但操作过程繁琐，检测费用高。例如，中国专利申请201010609217.4、“一种检测人细胞色素P450CYP2C19基因突变的方法及试剂盒”，其涉及PCR联合测序技术，只针对2个SNP位点进行检测。且测序技术的缺点在于不能多重检测，操作慢。因此不能解决以上技术问题。中国专利申请200610072593.8、“一种检测细胞色素P450酶系突变位点的寡核苷酸探针及基因芯片”，涉及芯片法，由于该方法所述的寡核苷酸探针采用荧光标记或生物素标记，因此存在合成探针成本高、过程复杂，因此也不能解决以上技术问题。综合所述，目前存在的技术问题是:缺乏一次能同时检测多个CYP450相关的基因多态位点的方法和产品，常见的检测 技术，如测序、实时荧光定量PCR等，均需对位点逐一进行检测，当位点较多时操作复杂，费用较高，因此目前需要一种不同于以往的检测技术，能在同一体系中针对同一个体的多个SNP进行检测，通过该技术的检测信息，为合理用药提供参考依据。
技术实现思路
本专利技术原理在于:提供了一种联合多重PCR技术、单碱基延伸技术和质谱检测技术，检测华法林用药剂量相关基因多态位点(SNP)的检测方案。其中:在多重PCR中同时扩增多达7个含SNP的DNA片段；在单碱基延伸过程中，对多重PCR的纯化产物进行多重单碱基延伸，延伸引物在7个SNP处分别延伸一个核苷酸，使得所延伸的核苷酸类型，分别与SNP处的基因型相关；单碱基延伸产生由延伸引物和延伸产物组成的待检混合物，以质谱对待检混合物进行检测，通过质谱峰确定待检混合物中各物质分子量，并与预先计算的各延伸引物和延伸产物的理论分子量进行比对，从而确定待检混合物是否包含特定的物质，进而确定各SNP处的基因型。因此，本专利技术第一个目的是提供一种检测7处与人细胞色素P450相关的基因多态位点的引物系统或引物组，其序列如表I所示。权利要求1.一种检测人细胞色素P450相关的基因多态位点检测的引物系统,其序列为: 基因多态位点扩增引物延伸引物CYP2C19 基因 rs56337013 位点(CYP2C19*5)，SEQ ID No:1_2，SEQ ID No:15 ；CYP2C19 基因 rs4986893 位点(CYP2C19*3)，SEQ ID No:3_4，SEQ ID No:16 ；CYP2C9 基因 rsl799853 位点(CYP2C9*2)，SEQ ID No:5_6，SEQ ID No:17CYP2C19 基因 rsl2248560 位点(CYP2C19*17)，SEQ ID No:7_8SEQ ID No:18 ;CYP2C9 基因 rsl057910 位点(CYP2C9*3)，SEQ ID No:9-10, SEQ I本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测人细胞色素P450相关的基因多态位点检测的引物系统，其序列为：基因多态位点??????????扩增引物?????????延伸引物CYP2C19基因rs56337013位点（CYP2C19*5），SEQ?ID?No：1?2，SEQ?ID?No：15；CYP2C19基因rs4986893位点（CYP2C19*3），SEQ?ID?No：3?4，SEQ?ID?No：16；CYP2C9基因rs1799853位点（CYP2C9*2），SEQ?ID?No：5?6，SEQ?ID?No：17CYP2C19基因rs12248560位点（CYP2C19*17），SEQ?ID?No：7?8SEQ?ID?No：18；CYP2C9基因rs1057910位点（CYP2C9*3），SEQ?ID?No：9?10，SEQ?ID?No：19CYP2C19基因rs4244285位点（CYP2C19*2），SEQ?ID?No：11?12，SEQ?ID?No：20；CYP2C19基因rs28399504位点（CYP2C19*4），SEQ?ID?No：13?14，SEQ?ID?No：21。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：马庆伟，赵洪斌，张海燕，赵艳梅，
申请(专利权)人：向华，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。