乙型肝炎病毒核心启动子区突变及其用途制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，公开了检测核酸样品中是否存在乙型肝炎病毒核心启动子区变异的试剂或试剂盒。本发明专利技术还公开了体外检测核酸样品中乙型肝炎病毒核心启动子区变异的方法。本发明专利技术首次揭示乙型肝炎病毒核心启动子区第１７６６或１７６８位的碱基的突变与肝癌的发生密切相关。并且还发现，该两个位点或其一结合第１７６２或１７６４位突变的累积可提高肝癌发生的可能性。

Hepatitis B virus core promoter region mutation and use thereof

The invention belongs to the technical field of biology, and discloses a reagent or a reagent box for detecting whether a hepatitis B virus core promoter region exists in a nucleic acid sample. The invention also discloses a method for detecting the variation of hepatitis B virus core promoter region in nucleic acid samples in vitro. The invention discloses for the first time that the mutation of the base of the 1766th or 1768 bit of the core promoter region of hepatitis B virus is closely related to the occurrence of liver cancer. It was also found that the accumulation of either 1762nd or 1764 - site mutations in either of these two loci or one could increase the likelihood of hepatocarcinogenesis.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体地说，本专利技术涉及乙型肝炎病毒核心启动 子区突变，可根据所述突变情况来制备判断病人易感性和/或预后的检测试剂 或试剂盒。
技术介绍
2000年调查数据显示，原发性肝细胞肝癌(以下简称肝癌)是全球第五种常 见恶性肿瘤，其死亡率居全球第三位。中国1990-1992年的抽样数据同样显示， 全国肝癌标化死亡率为17. 83/10万，约占癌症死亡的18.82%，居第2位。流 行病学资料表明乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒慢性感染以及黄曲霉毒素 暴露是肝癌发生的重要外界环境危险因素，最新调查数据显示，约53%的肝癌 发生与HBV感染有关，HBV对人类生命健康造成了极大的危害。江苏启东是中国肝癌高发区，也是重要的肿瘤高发现场。HBV感染和黄曲 霉毒素暴露是启东肝癌发生的主要原因。启东自然人群中HBsAg与肝癌关系的 前瞻队列显示，男性HBsAg (+)者与(-)者的肝癌发生率分别为619.30/10万与 51.70/10万，RR为11.98;而女性HBsAg(+)者与(-)者的肝癌发生率分别为 193. 96/10万与11. 37/10万，RR为17. 06，差异均有显著性。可见，HBV与肝 癌的因果关系强烈。启东长期的肿瘤登记资料显示，肝癌一直是启东居民第1 位的恶性肿瘤，根据1978-2002年的调査数据显示，启东男女性肝癌年龄调整 发病率分别为79.6/10万与23. 1/10万；相比之下，全国2000年估计的肝癌 年龄调整发病率分别为38. 9/10万与14. 5/10万。乙型肝炎病毒DNA为部分环状双链DNA，约有3200碱基对，由正链和负链 构成。负链有4个开放读码区(0RF)，分别为前S/S区，前C/C区，P区和X区。 除此之外还有多个基因表达调控序列，包括2个直接重复序列(DRI、 DRII)、 2 个增强子(ENI、 ENII)和4个启动子(SP1、 SP2、 XP和CP) 。 S区包括S、 pre-Sl 和pre-S2，可以合成小蛋白、中蛋白及大蛋白。前C/C区用于合成HBcAg和 HBeAg， X区和P区分别合成HBx和DNA聚合酶。CP(nt. 1643-1849)包括BCP区(basal core promoter, BCP)和上游调节区(URR) 。 BCP (nt. 1742 - 1849)指 导3. 5 kb前C mRNA (pre-C mRNA)和2. 4 kb前基因组m腿(prege國e mRNA) 的转录，是HBV复制的重要调控区。URR (nt. 1643-1741)位于BCP的5'端， 总体来讲它可以在肝细胞内刺激pre-C mRNA和pgRNA的转录。HBV复制过程中要经过逆转录，由于逆转录酶缺乏有效的碱基校对功能， 故HBV基因组比一般DNA病毒易发生变异。HBV的不同基因区均可发生突变， 病毒DNA序列突变可能导致病毒在宿主体内持续存在，导致慢性感染，甚至致 癌。随着对HBV与肝癌关系研究的深入，到目前为止，人们发现了许多与肝癌 发生密切相关的突变位点。BCP区nt. 1762A—T和nt. 1764G—A的双突变最常 见，是HBV典型的突变类型之一。BCP发生变异，影响HBV复制，同时也下调 HBeAg的合成，与疾病的不良预后密切相关。转染实验研究表明， nt. 1762T/1764A双突变可以减少pre_C mRNA的量和HBeAg的分泌。BCP突变 还可以上调病毒的复制，可能通过增加m脂A转录来上调基因组的表达。最近 冊V双突变与肝癌发生的关系也受到广泛的重视。有研究结果提示， nt. 176271764^双突变与肝脏病变的严重程度相平行，从3%的无症状携带者到 64。/。的肝细胞癌(HCC)患者(0R-20. 04， 95%CI 7.25-55.4 ，代O. 001)，双突变与 肝癌相关有非常显著性(OR-IO. 60 , 95%CI 4.92-22.86,代O. 001)。HBV X基因(简称HBx基因，或X基因)是HBV DNA中最小的ORF，位于 nt. 1374 nt. 1838之间，编码154个氨基酸。根据HBx蛋白的功能，它可分为 2部分近氨基端的1 50 aa为其自身的调控区域，该区域(1 20 aa)能够抑 制HBx蛋白的反式激活活性；另一部分为近羧基端的51 154aa为其反式激活 区域，该区域是HBx蛋白发挥其反式激活作用的基础，该区域的某些基因发生 点突变或缺失，就会对其反式激活作用造成影响。HBx蛋白研究显示，HBx的 反式激活作用是HBV自身复制和感染宿主细胞所必需的，并促使肝脏慢性炎症 和肝硬化的发生。研究表明，HBx蛋白本身不能与双链DNA结合，主要是通过 蛋白质与蛋白质的相互作用，与DNA结合蛋白转录因子相互作用，直接或间接 作用于相关基因的启动子或增强子，来实现其反式激活功能。HBx对其自身启 动子和许多细胞基因启动子都有正向调节作用，可激活病毒和细胞基因，在HBV 感染并发展为肝细胞癌的过程中发挥了重要作用。HBx基因的3'末端与HBV 的核心启动子CP湘重叠，因此，BCP区核苷酸变异可引起相应位置HBx蛋白氨 基酸的变异，从而通过影响HBx蛋白的功能而起到致癌作用。通过质谱分析，Kuang等报道启东HCC病人的血清标本和组织标本中HBV T1762/A1764突变率分别为53. 3%和74. 3%，但有关乙型肝炎病毒感染在肝癌发 生中的作用及如何发生作用的研究较少。由于癌症是危害人类健康的主要疾病之一。为了有效地治疗和预防肿瘤 (如肝癌)，目前人们已越来越关注肿瘤的早期诊断和预后，尽管目前本领域已 经发现了一些位点的突变与肝癌有关，然而还有必要作进一步研究，从而为肝 癌的诊断、分型或预后提供更详尽的依据，进一步提高诊断、分型或预后的准 确性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供检测核酸样品中是否存在乙型肝炎病毒核心启动子 区变异的试剂或试剂盒。本专利技术的另一目的在于提供体外检测核酸样品中乙型肝炎病毒核心启动子 区变异的方法。在本专利技术的第一方面，提供一种检测核酸样品中是否存在乙型肝炎病毒核心 启动子区变异的试剂盒，它包括容器，以及装于所述容器的特异性扩增乙型肝炎病毒核心启动子区第1768位为 碱基A的序列的引物；或容器，以及装于所述容器的与乙型肝炎病毒核心启动子区第1768位为碱基A 的序列结合的探针；或容器，以及装于所述容器的可特异性识别乙型肝炎病毒核心启动子区第1768位 为碱基A的序列的限制性内切酶。在另一优选例中，所述的试剂盒还包括容器，以及装于所述容器的特异性扩增乙型肝炎病毒核心启动子区第1766位为 碱基T的序列的引物；或容器，以及装于所述容器的与乙型肝炎病毒核心启动子区第1766位为碱基T 的序列结合的探针；或容器，以及装于所述容器的可特异性识别乙型肝炎病毒核心启动子区第1766位 为碱基T的序列的限制性内切酶。在另一优选例中，所述的试剂盒还包括6容器，以及装于所述容器的特异性扩增乙型肝炎病毒核心启动子区第1762位为 碱基T的序列的引物；或容器，以及装于所述容器的与乙型肝炎病毒核心启动子区第1762位为碱基T 的序列结合的探针；或容器，以及装于所述容器的可特异性识本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测核酸样品中是否存在乙型肝炎病毒核心启动子区变异的试剂盒，其特征在于，它包括：　容器，以及装于所述容器的特异性扩增乙型肝炎病毒核心启动子区第１７６８位为碱基“Ａ”的序列的引物；或　容器，以及装于所述容器的与乙型肝炎病毒核心 启动子区第１７６８位为碱基“Ａ”的序列结合的探针；或　容器，以及装于所述容器的可特异性识别乙型肝炎病毒核心启动子区第１７６８位为碱基“Ａ”的序列的限制性内切酶。

【技术特征摘要】
1. 一种检测核酸样品中是否存在乙型肝炎病毒核心启动子区变异的试剂盒，其特征在于，它包括容器，以及装于所述容器的特异性扩增乙型肝炎病毒核心启动子区第1768位为碱基“A”的序列的引物；或容器，以及装于所述容器的与乙型肝炎病毒核心启动子区第1768位为碱基“A”的序列结合的探针；或容器，以及装于所述容器的可特异性识别乙型肝炎病毒核心启动子区第1768位为碱基“A”的序列的限制性内切酶。2. 如权利要求l所述的试剂盒，其特征在于，还包括容器，以及装于所述容器的特异性扩增乙型肝炎病毒核心启动子区第1766位为 碱基T的序列的引物；或容器，以及装于所述容器的与乙型肝炎病毒核心启动子区第1766位为碱基T 的序列结合的探针；或容器，以及装于所述容器的可特异性识别乙型肝炎病毒核心启动子区第1766位 为碱基T的序列的限制性内切酶。3. 如权利要求l所述的试剂盒，其特征在于，还包括容器，以及装于所述容器的特异性扩增乙型肝炎病毒核心启动子区第1762位为 碱基T的序列的引物；或容器，以及装于所述容器的与乙型肝炎病毒核心启动子区第1762位为碱基T 的序列结合的探针；或容器，以及装于所述容器的可特异性识别乙型肝炎病毒核心启动子区第1762位 为碱基T的序列的限制性内切酶。4. 如权利要求l所述的试剂盒，其特征在于，还包括容器，以及装于所述容器的特异性扩增乙型肝...

【专利技术属性】
技术研发人员：屠红，郭霞，金晏，钱耕荪，曹志刚，
申请(专利权)人：上海市肿瘤研究所，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]