高产L-色氨酸的大肠杆菌工程菌制造技术

本发明专利技术提供了高产L-色氨酸的大肠杆菌工程菌，其是以大肠杆菌W3110为出发菌，采用tac启动子突变体串联基因组上表达trpEfbrDCBA基因，同时失活或敲除大肠杆菌W3110中的tnaA、trpR和tyrR基因，并突变tyrA和pheA基因，使其表达的酶活力弱化，并向改造后的菌株中转入含有串联表达来源于大肠杆菌K12的AroFfbr或AorGfbr、tktA和ppsA基因以及来源于枯草芽孢杆菌的SerA基因的低中拷贝质粒等系列技术组合筛选出工业化高产L-色氨酸、高葡萄糖转化率、生产发酵时间短的大肠杆菌工程菌。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物育种和微生物发酵领域，具体地说，涉及发酵高产L-色氨酸的大肠杆菌菌种的选育。
技术介绍
L-色氨酸是唯一有吲哚支链的芳香族氨基酸，化学名称为2-氨基-3-吲哚基丙酸。L-色氨酸是人体和动物体中的必需限制性氨基酸之一，在体内合成极微，需从外界摄取。它对人和动物的生长发育、新陈代谢起着重要的作用。目前被广泛地应用于医药、食品和饲料等领域。传统色氨酸生产方法主要有蛋白水解提取法、化学合成法、酶促转化法和微生物发酵法。前三种方法分别存在着材料来源有限、需多步合成工艺及光学拆分难、周期长、底物价格昂贵等缺点，在工业生产中受到极大限制。L-色氨酸的微生物发酵法是色氨酸生产的主要方法，即以淀粉或淀粉糖为原料，由微生物在高浓度条件下发酵后制得。自然界分离得到的野生型菌株酶能力和产生代谢产物的能力一般很低，很少能适合于工业化生产。传统诱变育种操作简单，实用性强，可以较快实现提高L-色氨酸产量的目的，在早期色氨酸育种和抗代谢反馈抑制酶起重要作用(J Bact，1990，172，6581 JBC 1991 (266) p8328 ；US 4371614，JP 57-071397)。但诱变育种有其局限性，如方向难以掌握，突变体难以集中多个理想性状等，使得色氨酸产量难以提高。近年来，随着基因克隆技术的发展，特别是代谢工程的发展，为廉价高效的色氨酸生产开辟了新途径。近年来，由于对色氨酸合成途径研究取得进展，基因工程(代谢工程)育种取得很大进展，并成功产业化。色氨酸基因工程(代谢工程)育种主要集中在以下几个方面芳香族氨基酸生物合成途径的第一步DAHP合成酶(AroF或AroG或AroH)抗反馈调控改造。 最初的成功是通过缺失aroF/aroG和aroH基因而简化系统的调控(tyrR调控消除)，进而对受酪氨酸调节的酶编码基因aroF/AroG进行体外突变，增加了它对反馈抑制的不敏感性(JBC 1991 (266)ρ 8328 ；Appl.Environ. Microbiol, Feb. 1997, p. 761 ;J. MOL 1965(44) p969 JP 57-071397 ；US 4560652 ;J Bact, Sept. 1976，p. 1085)。酪氨酸和苯丙氨酸分支途径分支酸变位酶tyrA和pheA的阻断或弱化(JBC 1972，247，p4447)；色氨酸酶(tnaA)基因的灭活，以防止所合成的色氨酸被降解(J.Bact，85，1965，p680)；邻氨基苯甲酸合成酶 (trpE)对色氨酸基因的不敏感性减缓色氨酸途径的反馈抑制改造以及调控基因TrpR失活 (EP 0293207 ；US 4371614 ；US 4588687 ；EP0338474)；突变色氨酰-tRNA 合成酶基因 trpS 以破坏细胞的衰减控制等等(CN 1156180A)；以及上述几个方面的组合(US7638312B2 ； Appl. Environ. Microbiol. 65，1999，p2497 ；EPA0401735)。上述方法只是在代谢通路方面采取了措施，按其所述方法构建的菌株在发酵放大过程中，菌株的生理生态控制不一定能按照设计目的获得高产、低能耗、高转化率生产L-色氨酸菌种。有的可能表达酶过量造成代谢负担，有的可能质粒拷贝数过高，消耗过多胞内资源；有的可能表达的蛋白之间不协调， 造成胞内资源浪费，结果产量过低或糖酸转化不高；有的可能产量高，但发酵时间过长，能耗大不利于产业化。
技术实现思路
本专利技术的目的是基于节约细胞资源和能耗，并提高细胞葡萄糖转化率的原则，提供一种高产L-色氨酸的大肠杆菌工程菌。为了实现本专利技术目的，本专利技术采用代谢工程育种方法建立系列菌株库，然后通过筛选的方法筛选得到高产、高转化效率、发酵时间短的高产L-色氨酸的大肠杆菌工程菌。 该代谢工程育种的方法是以大肠杆菌W3110(ATCC 27325)为出发菌，采用组成型tac启动子或其突变体替代色氨酸启动子，打破色氨酸合成的调控，同时敲除或失活大肠杆菌 W3110中的色氨酸降解基因，并改变芳香族氨基酸合成分支酸途径和色氨酸合成相关代谢流。本专利技术的代谢工程育种具体方法就是采用分子生物学技术敲除色氨酸降解的色氨酸酶(tnaA)基因、色氨酸操纵子中产生阻遏物基因trpR和调控蛋白的tyrR基因，突变酪氨酸和苯丙氨酸分支途径分支酸变位酶tyrA和pheA基因使之表达的酶活力弱化。整合基因组表达抗反馈trpEftoDCBA ；其启动子可以采用tac或tac-10区突变体。表达serA、 AroFfbr或AorG "、tktA、ppsA基因，启动子可以采用组成型启动子tac或tac-10区突变体或trc ；载体可以选择低、中拷贝质粒或直接整合到基因组中。本专利技术的表达IrpEftoDCBA启动子可以为tac或其突变体，其突变体可以为trc，或者-10区突变为TATATT或TATGAT。本专利技术的IrpEfb^AroFfto或AorGfto可来自于已经报道的突变体(JBC 1991 (266) ρ 8328 ；Appl.Environ. Microbiol, 1997, p. 761 ;J. MOL 1965(44)p969 ;J Bact, Sept.1976, p. 1085 ；胡昌云，AorG结构与功能研究，2003，复旦大学论文；FEMS, (2001)202 145-148 ； AEM 1979，ρ· 181 J Bact, OCt. 1971，p.400 ；China. 123. J Ind Microbiol Biotechnol 04 May, 2011 ；Appl. Environ. Microbiol, 43, 289, J Bact, 1990，172，6581)，也可以采用诱变和体外突变的方法得到。本专利技术所述突变tyrA和PheA基因突变弱化其酶活的方法可以采用细胞诱变或体外突变的方法得到，也可以采用(Bioorg. Med. Chem. (1996)4，1015-1020 ； Biochemistry (2007) 46，6883-6891 ；Biochemistry (1998) 37,15703-15712)报道的突变体，其tyrA突变可以为H131A或H153N或H189N或H197N或H239N或H245N或H257A或 H265A或H347N，优选为H131A。pheA基因突变可以为K39N或K39Q或K39R或Q88E或Q88R 或 L7C 或 L7M 或 D48Q 或 D48C 或 D48L 或 I81L 或 I81F 或 V35L，优选为 D48Q。根据上述方法，本专利技术进一步提供一种高产L-色氨酸的大肠杆菌(Escherichia coli)工程菌，其是以大肠杆菌W3110为出发菌，采用tac启动子突变体串联基因组上表达trpEftoDCBA基因，同时失活或敲除大肠杆菌W3110中的tnaA、trpR和tyrR基因，并突变 tyrA和pheA基因，使其表达的酶活力弱化，并向改造后的菌株中转入含有串联表达来源于大肠杆菌K12的AroFfto或AorGfto、tktA和ppsA基因以及来源于枯草芽孢杆菌的SerA基因的低中拷本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：于传军，左良成，徐宝兴，徐洪利，赵体金，李水仙，王东杰，戴晓燕，丁贞科，
申请(专利权)人：山东鲁抗生物制造有限公司，
类型：发明
国别省市：