一种重组蛋白的制备方法技术

本发明专利技术公开了SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列，以及包含该核苷酸序列的重组载体和重组菌；本发明专利技术还公开了一种重组蛋白的制备方法，以及该方法制得的重组蛋白与其抗病毒用途。本发明专利技术重组表达得到了抗病毒蛋白RC28，其抗病毒活性高，单疱病毒性角膜炎疗效确切，具有良好的临床应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及一种重组抗病毒蛋白RC28的制备方法。
技术介绍
病毒性疾病在人与动物传染病中约占60%，严重危害生命健康，因而抗病毒药物研究受到广泛关注，成为国际研究开发热点之一。单纯疱疹病毒(HSV)属于疱疹病毒科a病毒亚科，病毒质粒大小约180纳米，根据抗原性的差别目前把该病毒分为I型和2型。该病毒感染是人类的一种常见传染病，其感染部位广泛，常发于癌症或其他慢性病应用各种免疫抑制剂的病人中。现已正式，HSV感染与先天畸形、流产、宫颈癌、脑炎、新生儿疾病、性病等10多种疾病有关。目前国内外研究的抗病毒药物较多，但过度到临床治疗全身性感染的药物有限，且已被发现有耐药株。单疱病毒性角膜炎(herpes simplex kerratitis, HSK)是单纯疱疫病毒I型感染眼部引起，该病毒是一种常感染人的DNA病毒，在人群的感染很普遍，感染率高达90%以上，是目前的致盲眼病之一。抗单疱病毒性角膜炎的药物主要有核苷类药物和非核苷类药物。目前抗HSV-1药物存在药物作用机制相似、疗效不稳定、毒副作用较大及易于产生交叉耐药性等问题，因此寻找新的抗病毒药物是国际研究开发热点之一。专利号ZL200910137386.X，专利技术名称“一种抗病毒蛋白及其制备方法和应用”的专利公开了一种抗病毒蛋白RC28，抗病毒蛋白RC28是从天然皱盖罗鳞伞中分离纯化的，具有较强的抗HSV-1病毒效果。但是，皱盖罗鳞伞生长条件严苛，四川阿坝州高海拔山区为国内仅有的少数产地之一，采集受季节限制，产量不稳定，难以满足临床需求，分离纯化的成本也很高。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种用基因工程的方法重组表达抗病毒蛋白RC28的方法，为了实现重组表达，提供了一种新的核苷酸序列，以及含有该序列的重组载体和重组菌。本专利技术提供的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本专利技术重组载体包括SEQ ID NO.1或所示的核苷酸序列。优选地,所述重组载体是pET26b(+)重组载体。本专利技术重组菌，它包括前述的重组载体。优选地，所述重组菌为重组大肠杆菌。本专利技术制备重组蛋白的方法，它包括如下步骤(I)取前述的重组菌,在大肠杆菌培养基中培养,诱导表达,得菌液,离心,得菌体；(2)取步骤(I)所得菌体，裂解，离心，得上清和沉淀，复活沉淀，与上清合并，分离纯化，即得。其中，步骤(I)所述培养是在含有4(T60mg/ml卡那霉素的LB液体培养基中振摇培养，培养温度为37°C。其中，步骤(I)所述诱导表达使用的诱导剂为IPTG，诱导剂的浓度为O. rimM,诱导温度为16 37°C，诱导时间为6 18h。优选地，所述步骤(I)中，诱导剂的浓度为ImM，诱导时间为18°C，诱导时间为18h。其中，步骤(2)所述分离纯化采用Ni亲和层析柱。本专利技术还提供了前述方法制备的重组蛋白及其在在制备抗病毒药物中的用途。优选地，所述抗病毒药物为抗单纯疱疹病毒的药物。进一步优选地，所述抗病毒药物为治疗单疱病毒性角膜炎的药物。本专利技术用基因工程的方法制备得到了重组抗病毒蛋白RC28，该蛋白抗病毒活性高，单疱病毒性角膜炎的疗效确切，为临床抗病毒药物提供了一种新的选择，具有良好的工业应用前景。显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。附图说明 图1重组表达载体酶切结果。1:重组载体；2 NdeI/XhoI双酶切重组载体得到的载体和本专利技术重组蛋白(714bp) ；3 :分子量Marker。图2本专利技术重组蛋白的诱导表达结果。1:诱导前总蛋白；2_5 :不同的单克隆IPTG诱导后总蛋白表达谱。图3本专利技术重组蛋白的可溶性鉴定结果。1、3、5、7 :诱导后超声破碎上清；2、4、6、8 :诱导后超声破碎沉淀。图4本专利技术重组蛋白Akta全自动层析系统结果图。图5本专利技术重组蛋白SDS-PAGED电泳图。1:过柱前上样液；2 :流穿液；3:100%Elution buffer 洗脱液；4:10%Elution buffer 洗脱液；5 20%Elution buffe 洗脱液；6 50%Elution buffe 洗脱液。图6本专利技术重组蛋白SDS-PAGED电泳图。SDS-PAGED电泳图。1:过柱前上样液；2 :镍柱纯化洗脱的本专利技术重组蛋白液；3 :超滤流穿液；4 :浓缩本专利技术重组蛋白液。图7本专利技术重组蛋白的测序结果。A :第一个氨基酸测序图；B:氨基酸对照图。图8本专利技术重组蛋白的western-blot检测。图9不同IPTG浓度的筛选结果。1、2、3条带分别代表O.1mmol/L、0. 5mmol/L、lmmol/LIPTG 浓度。图10不同诱导温度的筛选结果。1、2、3条带分别代表6小时，12小时，18小时。图11HSV-1病毒滴度测定。A :空白对照；B =HSV-1病毒10_2稀释液；C =HSV-1病毒10_3稀释液；D =HSV-1病毒10_4稀释液；E =HSV-1病毒10_5稀释液；F =HSV-1病毒10_6稀释液。图12RC28可溶性蛋白的抗HSV-1病毒的检测。A =HSV-1IO^3稀释液；B =HSV-1IO^4稀释液；C =HSV-1IO^5稀释液；D (HSV-1+RC28可溶性蛋白)10_3稀释液；E (HSV-1+RC28可溶性蛋白)10_4稀释液；F (HSV-1+RC28可溶性蛋白)10_5稀释液。图13Balb/c小鼠HSV-1模型。A :角膜病变结果；B :荧光染色结果；C和D :睑缘炎；E和F :角膜新生血管；G和H :基质性角膜炎。图14睑缘炎平均评分值。图15睑缘炎动物患病率。图16角膜新生血管平均评分值。图17角膜新生血管动物患病率。图18基质性角膜炎平均评分值。图19基质性角膜炎动物患病率。具体实施例方式实验材料pET26b (+)载体质粒、大肠杆菌DH5 α、胶回收试剂盒、T4连接酶、限制性内切酶Ndel/Xhol、LB液体培养基、IPTG、聚丙烯酰胺凝胶、裂解液(20mmol/L Tris-HCl pH8. O、O. 5mol/L NaClUmmol/L EDTAUmg/ml溶菌酶)、BCA蛋白定量试剂盒、RC28兔源多克隆抗体、山羊抗兔(HRP标记)二抗、Vero细胞、DMEM培养基、甲基纤维素、Balb/c小鼠、HSV-1病毒、更昔洛韦及其他常规化学试剂均为市售品。实施例1本专利技术重组抗菌肽的制备一、重组抗菌肽基因工程菌的构建1、目标基因片段的制备根据经验，设计目标基因片段如下(SEQ ID NO.1所示)，在两端添加酶切位点后如下CATatg ctgacctatcgcggcaaactgaactggtataactacgctgtgaacgagggcttcaccctcatccttcctggcccggagctcaaggtcggtgcgcctgctattgctgtctggcaatggacggtggatgcgacgggtgccgagaagg本文档来自技高网...

【技术保护点】
SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。2.一种重组载体，其特征在于它包括SEQ ID NO.1或所示的核苷酸序列。3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于它是pET26b(+)重组载体。4.一种重组菌，其特征在于它包括权利要求2或者3所述的重组载体。5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于它为重组大肠杆菌。6.一种制备重组蛋白的方法，其特征在于它包括如下步骤 (1)取权利要求4或者5所述的重组菌，在大肠杆菌培养基中培养，诱导表达，得菌液，离心，得菌体； (2)取步骤(I)所得菌体，超声裂解，离心，得上清，分离纯化，即得。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于步骤(1)所述培养是在含有40~60mg/ml卡那霉素的LB液体培养基中振摇...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫乃红，蔡素萍，周晓敏，殷燕，王云，刘旭阳，皮耐诺·弗兰克，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：