携带双筛选基因的真核表达载体构建及其应用制造技术

本发明专利技术具体涉及一种携带dhfr和neo基因的真核表达载体pAAV2neo-dhfr，该表达载体主要由AAV2的ITR、neo基因表达框、dhfr基因表达框和外源基因表达框组成，其中外源基因表达框中含有多克隆位点MCS，用于表达外源基因的插入。使用时将外源基因插入其表达框的多克隆位点之间，获得外源基因的表达载体，转染表达细胞，多种策略筛选获得外源基因的稳定高表达细胞株。由于该载体携带AAV2的ITR序列，因此有利于外源基因稳定表达细胞株的获得。同时，该载体包含两种筛选基因，适用于多种表达细胞并缩短稳定高表达细胞株的筛选过程。本载体可高效地真核表达多种外源基因，为真核蛋白的表达提供了新的选择。

【技术实现步骤摘要】
携带双筛选基因的真核表达载体构建及其应用本专利技术属于生物技术专利
本专利技术具体涉及一种携带dhfr和neo基因的真核表达载体pAAV2neo-dhfr，该表达载体主要由AAV2的ITR、neo基因表达框、dhfr基因表达框和外源基因表达框组成，其中外源基因表达框中含有多克隆位点MCS，用于表达外源基因的插入。使用时将外源基因插入其表达框的多克隆位点之间，获得外源基因的表达载体，转染表达细胞，多种策略筛选获得外源基因的稳定高表达细胞株。由于该载体携带AAV2的ITR序列，因此有利于外源基因稳定表达细胞株的获得。同时，该载体包含两种筛选基因，适用于多种表达细胞并缩短稳定高表达细胞株的筛选过程。本载体可高效地真核表达多种外源基因，为真核蛋白的表达提供了新的选择。 背景表达载体是一种将外源基因导入宿主细胞，并使宿主细胞稳定表达外源基因的运载工具。根据宿主细胞的不同,表达载体可分为以大肠杆菌为主要宿主的原核表达载体和以酵母、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞为宿主的真核表达载体。所谓真核表达载体指的是将外源基因导入真核宿主细胞(如酵母、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞)的工具，而且其携带的结构元件不仅直接影响外源基因的表达水平还影响外源基因稳定表达细胞株的获得。为了实现外源基因的稳定闻效表达，真核表达载体通常具有以下基本兀件真核启动子、多克隆位点、加尾信号序列、真核筛选基因表达框以及原核复制子和筛选基因表达框，其中启动子调控外源基因的转录，多克隆位点用于外源基因的插入，真核筛选基因用于筛选获得稳定表达外源基因的细胞株，原核复制子和筛选基因则用于真核表达载体的构建和扩增。在真核表达载体中，常用的真核启动子为巨细胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)启动子、小鼠巨细胞病毒(Mouse cytomegalovirus, mCMV)启动子和猴空泡病毒40 (Simianvirus 40，SV40)启动子等。这些启动子均具有很高的转录活性，有利于外源基因的高效表达。利用真核筛选基因获得外源基因稳定表达细胞株，是蛋白表达过程中常用的一种策略。目前常用的真核筛选基因为neo (氨基糖苷磷酸转移酶)基因、dhfr( 二氢叶酸还原酶)基因、puro (嘌呤霉素乙酰转移酶)基因和Hyg(潮霉素B磷酸转移酶)基因等。其基本原理是当真核表达载体转染宿主细胞后，用含有真核表达载体表达筛选基因的作用底物(该底物通常会抑制细胞株的生长或导致细胞死亡)的培养基进行选择培养，转导真核表达载体的细胞由于表达筛选基因而存活且生长，未转导真核表达载体的细胞则生长受到抑制或死亡。在实际操作中，获得稳定表达外源基因的细胞株以后，因细胞株中不同细胞间外源基因表达水平差异，通常还需将细胞单克隆化，进一步筛选获得高表达的单克隆细胞株。neo基因是一种常用的获得稳定表达细胞株的筛选基因，编码氨基糖苷磷酸转移酶，其作用原理是氨基糖类抗生素G418通过影响核糖体80S亚基功能抑制蛋白质合成，从而对真核细胞产生毒性，当neo基因整合进入细胞基因组后，稳定表达氨基糖甘膦酸转移酶，使G418磷酸化，导致其失活，细胞存活并生长。neo基因作为一种选择标记基因，以广泛地应用于稳定转染外源基因细胞株的筛选。以neo基因为筛选基因且来源于ATCC(American Tissue Culture Colection)的 pSV2neo,作为一种经典的表达载体，现在仍存在较为广泛的应用。dhfr基因编码二氢叶酸还原酶,含有NADPH的二氢叶酸还原酶催化二氢叶酸还原成四氢叶酸，为核苷酸的从头合成提供一碳单位。二氢叶酸还原酶缺陷性细胞由于缺乏核苷酸从头合成所必需的二氢叶酸还原酶，需要在培养基中加入次黄嘌呤和胸腺嘧啶，细胞利用次黄嘌呤和胸腺嘧啶通过核苷酸补救合成途径合成细胞生长所必需的核苷酸而维持生长。以dhfr为筛选基因，CH0/dhfr_细胞转染真核表达载体后可以在不含次黄嘌呤和胸腺嘧啶的培养基中生长，同时在培养基中加入氨甲喋呤可以使外源基因的拷贝数扩增，提高外源基因的表达水平(Nunberg J. H.，KaufmanR. J.，Schimke R. T.，et al. Amplifieddihydrofolate reductase genes are localized to ahomogeneously staining regionof a single chromosome in a methotrexate—resistantChinese hamaster ovary cell line. Proc. Natl. Acad. Sc1. USA, 1978,75(11) :5553-5556.)。而且CHO细胞使用时间长，遗传背景清楚，既能贴壁培养又能悬浮培养，较易转染外源基因，是重组蛋白表达常用的细胞株。因此，dhfr基因通常作为CHO/dhfr—细胞株表达外源基因的选择基因。为了提高外源基因表达细胞株基因组中的整合频率，美国专利(U. S.Pat.No. 5928914)描述了一种利用Cre-1ox酶系统使表达外源基因定点整合而获得稳定表达细胞株的方法，而且选择整合频率较高的载体(如逆转录病毒载体)也有助于表达外源基因的整合。逆转录病毒载体中的长末端重复序列(Long Terminal Repeat, LTR)有利于实现外源基因的整合。与此相似，腺相关病毒(Adeno-associated virus, AAV)的反向末端重复序列(Inverted Terminal Repeat, ITR)可在没有辅助病毒的存在的情况下,使位于两个ITR之间序列以附加体(episome)的形式存在于细胞内(Nakai H. , Storm T. A. and KayM. A. Recruitment of single-stranded recombinant adeno-associatedvirus vectorgenomes and intermolecular recombination are responsible for stabletransductionof liver in vivo. J Virol.，2000，74 (20) :9451-9463. Nakai H. ,Yant S. R. , Storm T. A.，et al. Extrachromosomal recombinant adeno-associated virus vector genomesareprimarily responsible for stable liver transduction in vivo. J Virol. ,2001,75(15) :6969-6976.),并在辅助病毒协助下实现序列的整合(Deyle D. R. and RussellD. ff. Adeno-associated virus vector integration.Curr. Opin. Mol. Ther. , 2009,11(4)442-447.)。美国专利(Pub. No. US 2003/0064517A1)报道了一种携带neo基因和dhfr基因的真核表达载体，其本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种携带dhfr和neo基因的真核表达载体pAAV2neo?dhfr，该表达载体的技术特征主要由AAV2的ITR、neo基因表达框、dhfr基因表达框和外源基因表达框组成。

【技术特征摘要】
1.一种携带dhfr和neo基因的真核表达载体pAAV2neo_dhfr,该表达载体的技术特征主要由AAV2的ITR、neo基因表达框、dhfr基因表达框和外源基因表达框组成。2.如权利要求1所述，使用时将外源基因插入到外源基因表达框的多克隆位点之间，获得外源基因的表达载体，转染表达细胞，多种策略筛选获得外源基因的稳定高表达细胞株。3.如权利要求1所述，该载体包含两种筛选基因，适用...

【专利技术属性】
技术研发人员：董小岩，田文洪，吴小兵，董哲岳，
申请(专利权)人：北京五加和分子医学研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：