富含生长因子(PGF)的人类血小板萃取物可用于伤口疗愈及干细胞扩增，近来日益受到关注。本发明专利技术关于一种含有病毒去活化的生长因子且PDGF及VEGF耗尽的血小板裂解物，优选为富含TGF、IGF及EGF者。本发明专利技术进一步关于一种得到上述血小板裂解物的方法，其包含下列步骤：使起始血小板浓厚液与一溶剂及/或清洁剂接触；使所述起始血小板浓厚液与溶剂及/或清洁剂共同培养一段至少5分钟至6小时的时间，其pH值维持在从约6.0至约9.0的范围内，且其温度是在从2℃至50℃的范围内；通过油萃取来选择性移除上述溶剂及/或清洁剂，以得到一水性蛋白相；以及将该经溶剂及/或清洁剂处理的血小板浓厚液或该水性蛋白相与活性碳共同培养。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术关于血小板衍生物的领域，特别是关于得自人类或动物源血小板的生长因子浓厚液的领域。本专利技术还关于ー种制备这类含有生长因子的血小板裂解物的方法，及其在试管内(in vitro)、活体外(ex vivo)的细胞培养(例如干细胞扩增及分化)的用途、美容或临床的应用，如与骨移植体的组合应用。
技术介绍
蛋白体学分析的证据显示，人类血小板包含大量具有重要生理功能的分子，其中又以生长因子(GF)最受瞩目。这些生长因子堆积在血小板的α-颗粒内，主要 包括三种血小板衍生的生长因子的异构体(H)GF-AA、-AB及-ΒΒ)、血管内皮生长因子(VEGF)、转形生长因子-β (TGF-β I及TGF12)、表皮生长因子(EGF)、纤维母细胞生长因子(FGF)、以及ー些类胰岛素生长因子(IGF)。现已根据这些生长因子的治疗标的，将复杂的人类血小板生长因子混合物以单ー捐输者(single-donor)血小板凝胶生物材料的形式用于治疗方面的应用，上述血小板凝胶生物材料是通过凝血酶对含血小板的血浆进行活化后得到。血小板活化通常会使包含在血小板内的生长因子释出，在此同时，凝血酶会使纤维蛋白原转变成纤维蛋白而形成凝胶基质(gel matrix)，这类凝胶基质会将生长因子抓在里面。这项生物材料一般会单独施用或与移植材料(graft materials)共同施用在组织上，故可将含有生长因子的血小板凝胶(platelet gels)用于再生医学(regenerativemedicine)，以促进软组织及硬组织的愈合及再生。亦可将从血小板得到的生长因子浓厚液补充在试管内(in vitro)或活体外(ex vivo)的细胞培养的生长培养基中。近来已证明，可能使用富含人类生长因子的血小板释出物来取代胎牛血清(fetal bovine serum,FBS),而使间质干细胞(mesenchymal stem cells)或造血干细胞(hematopoietic stem cells)在活体外(ex vivo)中扩增。目前将富含生长因子的血小板释出物应用于干细胞扩增一事倍受瞩目，特别是在公认的新“广效”细胞(即间质干细胞mesenchymal stem cells, MCS),或造血干细胞(hematopoietic stem cells))扩增中用来作为胎牛血清(FBS)或胎犊血清(fetal calfserum, FCS)的替代品,这些血清普遍被视为普利子蛋白(prion)及病毒的可能传染源，也被视为在病患身上造成免疫问题的原因，这是胎牛血清或胎犊血清中残余的牛蛋白和抗原所造成的。最近已发展出新的策略，包括在公知表现系统中生产重组血小板生长因子，如将某重组人类个体(Rh)生长因子用于治疗用途。某些国家已核准将基因工程酵母菌所表现的Rh-PDGF-BB用于治疗慢性神经病变型下肢糖尿病性溃疡(chronicneuropathiclower-extremity diabetic ulcers),不过，要达到临床成效需要施用高剂量的这种单一生长因子数周之久。同样地，TGF-β超级家族中的Rh-骨型态发生蛋白(Rh-bonemorphogenetic proteins,BMP)BMP-2及BMP-7可从中国仓鼠卵巢细胞制得，并已核准用于治疗某些骨折手术。然而，可用的重组生长因子数目仍然非常有限，部分是因为这些生长因子在分离、鉴定、选殖及表现方面的难度所致。进ー步言之，血小板衍生的制备物的优点仍比使用单一重组因子要多，这是因为在某些应用中，生长因子的组合可达到优势协同作用(synergistic effect)。目前数据显示生长因子TOGF及VEGF是直接与异常细胞增殖及/或分化有关(例如可參见 Ferrara et al. , Nature Medicine, vol. 9, no. 6, 2003, pp. 669-676 ;以及EuropeanMedical Agency 在 2010 年 2 月 18 日刊行的 EMA/92326/2010，和 FDA 于 2008 年3 月 27 日的通Tfi“an ongoing safety review of regranex(becaplermin)，'ノ。由十在以TOGF及VEGF个别进行的治疗中，发展中癌症的感受性(susceptibility)増加了，因此要避免将这两种生长因子用于培养干细胞或治疗病患，特别是当该病患已有罹癌风险的时候。因此，目前确有发展处理人类血小板材料的方法的需要，这些方法是用以制备已定性且具病毒安全性的エ业生长因子制备物，特别是其中I3DGF及VEGF耗尽的制备物。专利申请W02009/087560已揭露可使人类血小板浓厚液接受溶剂及清洁剂组合 (S/D)的处理来达到双重目的(a)脂质包膜病毒的去活化，以及(b)从血小板α-颗粒大量释出生长因子。之后可通过结合S/D处理、油萃取及疏水性交互作用层析(HIC)步骤而得到ー标准化复杂血小板生长因子混合物，其包含H)GF-AB、-BB及-AA、TGF-β、EGF、VEGF,以及类胰岛素生长因子-β I (IGF-β I)，其中油萃取及HIC是用以移除S/D试剂而不会显著影响PGF及蛋白的含量。所得血小板生长因子制备物显示可在试管内刺激多种细胞株，并促使由抽脂取得的脂肪组织当中的干细胞扩增。此外，W02009/087560亦揭露了以SP-sepharose阳离子交换管柱来取代HIC,以制备经纯化的FiDGF-VEGF流析物(fraction)。在这项方案中，PDGF及VEGF确实可被吸附在管柱上，但TGF-β、EGF、IGF则与在病毒去活化步骤中使用的S/D试剂一同在前缘部分(breakthrough)出现。反言之，W02009/087560揭露的是可通过DEAE-s印harose阴离子交换取代HIC的方式将TGF- β及EGF纯化到一定的程度。在El-Ekiaby et al.所发表的文献(El-Ekiaby et al ； , ^Solvent-detergentiiltered(b/D_F)iresh frozen plasma and cryoprecipitate minipools prepared in anewly designed integraldisposable processing bag system，，,Transfusion medicine,2010,20,48-61)当中，作者揭露了ー种方法，其可用于单ー来源(singulet)或迷你集池(mini-pools)的输血用血浆及冷冻沉淀品的病毒去活化处理，包含下列主要步骤以TnBP及Triton X_45的混合物对新鲜冷冻血浆(FFP)、冷冻沉淀品贫乏的血浆(Cryo-PoorPlasma, CPP)或冷冻沉淀品进行S/D处理；对经S/D处理的血浆材料进行油萃取；以及透过含有经活化的活性碳的S/D吸收过滤器来过滤经油萃取的血浆材料。如该文献的讨论所述，其所揭露的方法特别是能够保存血浆蛋白(例如凝血因子)的功能活性，不会改变VWF多聚体组成物(VWF mu I timer composition),且会将TnBP及Triton X-45减本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：席耶利·布诺夫，苏正尧，
申请(专利权)人：国维联合科技股份有限公司，
类型：
国别省市：
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