Paa蛋白及由其制备的抗体与应用制造技术

本发明专利技术公开了Paa蛋白及由其制备的抗体与应用。本发明专利技术提供Paa蛋白在制备具有如下1）-3）中至少一种功能的产品中的应用：1）预防和/或治疗由病原菌EHEC引发疾病；2）降低病原菌EHEC肠道感染损伤；3）降低病原菌EHEC在肠道定值力；所述Paa蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。本发明专利技术的实验证明，本发明专利技术通过基因工程技术克隆获取Paa蛋白的编码基因、重组表达和纯化Paa蛋白，体内外评估Paa蛋白的免疫学功能等实验研究，Paa蛋白可被O157：H7感染血清所特异的、高效的识别，是EHEC病原菌重要的核心抗原，可作为抗原试剂用于感染诊断；Paa蛋白免疫的小鼠可以抵制O157：H7攻毒，表明该蛋白可以作为针对EHEC引发疾病的疫苗。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，尤其涉及Paa蛋白及由其制备的抗体与应用。
技术介绍
肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhage E. coli,EHEC)是毒力最强、致病性也最强的大肠杆菌，受到广泛的关注。EHEC感染可使人患腹泻、出血性结肠炎(HC)，还可引发溶血性尿毒综合症(HUS)及血栓性血小板减少紫癜(TTP)等严重并发症，严重者可导致死亡，致死率达5% 10%。2011年4月，德国暴发了肠出血性大肠杆菌0104 :H4感染和溶血性尿毒综合征(HUS)疫情，蔓延到欧洲和北美洲的16个国家。同年四、五月间，日本富山地区暴发了新感染疫情，血清型为0111，某些病例在引起HUS之后，出现了神经症状，并发弥散型血管内凝血和脑病。在EHEC中，致病性强、危害大的还有0157 :H7。自1975年被首次分离、1982年被确认为致病菌以来的20多年中，世界各地包括中国都有不同规模的暴发流行。 1999年在我国江苏、安徽两省有过大规模暴发流行，患者超过2万例，死亡177例。EHEC感染已经成为欧美国家儿童肾衰的首位病因，对人们的健康构成了巨大威胁。另外，作为一种重要的人兽共患病病原体，EHEC病原菌可长期驻留于牛、羊、猪、鸡等家畜家禽的肠道中，造成动物的腹泻，并污染畜禽的肉奶蛋制品以及水源和农作物等，给农牧业生产造成巨大的损失。因此，EHEC感染已经成为全球性的公共卫生问题。目前，临床针对EHEC感染主要采取对症治疗，因为抗生素治疗具有加剧病情的危险性而被谨慎使用，没有可以使用的疫苗和特异治疗药物。疫苗被认为是应对EHEC暴发流行和散发感染最简单，经济，快捷的手段。如果能发现和获得核心抗原或优势保护性抗原，就可以进一步发展为新型疫苗。黏附定植是细菌感染损伤的关键环节，细菌黏附于宿主上皮细胞导致A/E(Attaching and effacing, Α/E)病变。Tir、Intimin、Map、EspF、EspG、EspH、SepZ、EspB都是已被公认的由LEE编码的效应分子，都参与EHEC的Α/E损伤。但研究人员发现仍然存在另一些非LEE编码的效应分子。Paa (porcine attaching and effacing associated)为 753bp 基因编码的27. 6kDa蛋白，序列分析发现paa基因编码蛋白的氨基酸序列在0157 H7EDL933和Saikai中完全一致。染色体定位技术发现包含paa基因的区域位于染色体上,在yciD和yciE之间。Theresa等发现paa基因的EHEC缺失突变株会降低对hela细胞的黏附，同时也会降低某些细胞表面蛋白的分泌，这些蛋白有些对EHEC的分泌系统是不可或缺的，而这些分泌系统是EHEC黏附细胞的重要保障，所以Paa与EHEC的黏附有着某些关系。目前，多国科学家针对Paa蛋白的黏附功能和分子机制正展开研究，但迄今为止，还没有从免疫学角度上证实Paa分子在细菌感染检测、免疫防护方面的作用和功能。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供Paa蛋白的新用途。本专利技术提供的Paa蛋白在制备具有如下I) _3)中至少一种功能的产品中的应用I)预防和/或治疗由病原菌EHEC感染或引发的疾病；2)降低病原菌EHEC对肠道感染损伤；3)降低病原菌EHEC在肠道定值力；所述Paa蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。上述应用中,所述产品为疫苗或药物。上述应用中，所述肠道为人或动物肠道，在本专利技术的实施例中动物肠道为小鼠肠道；所述病原菌EHEC为EHEC 0157 :H7。 Paa蛋白作为靶标或检测标志物在开发或制备诊断感染病原菌EHEC的产品中的应用也是本专利技术保护的范围；在上述应用中，所述Paa蛋白的氣基酸序列为序列表中的序列2。本专利技术的另一个目的是提供一种产品。本专利技术提供的产品，其活性成分为Paa蛋白；所述产品为具有如下I) -3)中至少一种功能的产品I)预防和/或治疗由病原菌EHEC引发疾病；2)降低病原菌EHEC对肠道感染损伤；3)降低病原菌EHEC在肠道定值力。4)检测病原菌EHEC的感染。由Paa蛋白作为抗原制备的抗体也是本专利技术保护的范围；所述Paa蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。上述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。检测Paa蛋白的产品在制备用于诊断病原菌EHEC产品中的应用也是本专利技术保护的范围；所述病原菌EHEC具体为EHEC 0157 H7 ;上述检测Paa蛋白的产品具体为上述的抗体。上述的抗体在制备提高宿主抗病原菌EHEC感染产品或提高宿主抗病原菌EHEC黏附产品中的应用也是本专利技术保护的范围；上述应用中，所述宿主具体为人或动物；宿主尤其具体为人或动物内的细胞；所述病原菌EHEC具体为EHEC 0157 H7 ;在本专利技术的实施例中，用来证明提高宿主抗病原菌EHEC黏附是通过hela细胞作为宿主进行试验的。本专利技术的第三个目的是提供一种产品。本专利技术提供的产品，其活性成分为上述的抗体；所述产品为具有如下I) -3)中至少一种功能的产品I)用于检测病原菌EHEC ；2)提高宿主抗病原菌EHEC感染；3)提高宿主抗病原菌EHEC黏附；其中宿主具体为人或动物；宿主尤其具体为人或动物内的细胞；所述病原菌EHEC具体为EHEC 0157 H7 ;在本专利技术的实施例中，用来证明提高宿主抗病原菌EHEC黏附是通过hela细胞作为宿主进行试验的。本专利技术的实验证明，本专利技术通过基因工程技术克隆获取Paa蛋白的编码基因、重组表达和纯化Paa蛋白，体内外评估Paa蛋白的免疫学功能等实验研究,证实(I) Paa蛋白可被0157 :H7感染血清所特异的、高效的识别，是EHEC病原菌重要的核心抗原，可作为抗原试剂用于感染诊断；(2)Paa免疫的小鼠能够减少肠道里EHEC的定植；(3)Paa蛋白免疫的小鼠可以抵制0157 H7攻毒，表明该蛋白可以作为针对EHEC弓丨发疾病的疫苗；(4) Paa蛋白可用来制备抗体或抗血清，该抗体或抗血清可以特异识别EHEC菌体蛋白，能够作为抗体试剂检测EHEC病原菌；(5)Paa蛋白的抗体或抗血清能够拮抗EHEC病原菌对靶细胞的黏附效应，有效干预病原菌在肠道的定植，从而显著减低或几乎完全抑制病原菌感染对机体造成的损伤；(6) Paa蛋白可激发机体产生特异应答，具有高水平的免疫原性，通过诱导高效免疫效应，抵抗病原菌感染所造成的损伤或死亡。附图说明图I为Paa的纯化蛋白及WB印迹图2为抗体效价随免疫次数及间隔时间变化监测图3为免疫小鼠血清中IgA及IgG亚型的检测·图4为攻毒后小鼠排泄物中排菌量的检测图5为抗Paa抗血清的WB检验图6为Paa抗血清对细胞的抗黏附率具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。部分材料如下I、载体与菌株EHEC 0157 :H7EDL933株可由ATCC提供，目录号700927 ;公众也可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得，该菌株EDL933株记载在L. ff. Riley,R. S. Remis, S. D. Helgerson, H. B. McGee, J. G. Wells, B. R. Davis, R. J.本文档来自技高网...

【技术保护点】
Paa蛋白在制备具有如下1）?3）中至少一种功能的产品中的应用：1）预防和/或治疗由病原菌EHEC感染或引发的疾病；2）降低病原菌EHEC对肠道感染损伤；3）降低病原菌EHEC在肠道定值力；所述Paa蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王慧，李涛，王琴，韩燃，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所，
类型：发明
国别省市：